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[求助]
求助連接反應(yīng)中的問題，謝謝!
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大家好，連接反應(yīng)中遇到了問題，希望大家給予幫助，謝謝！ 最近一直在構(gòu)建重組質(zhì)粒載體，載體為PET28a，目的片段大約為500bp。因?yàn)槲沂窃谥貜?fù)師長的實(shí)驗(yàn)，師長使用的連接條件是：NEB連接酶，22度，10min。因?yàn)槲覀儧]有定NEB連接酶，因此在開始時，我使用的連接條件是Takara T4連接酶，22度，10min。后來發(fā)現(xiàn)連不上，便將條件調(diào)節(jié)為16度，3個小時�？墒寝D(zhuǎn)化涂板后發(fā)現(xiàn)依然沒有單克隆生長。凝膠顯示酶切也正常，回收片段的濃度也測定了，根據(jù)載體與目的片段1:10進(jìn)行連接，可是，就是長不出單克隆。 另外，想請問：加連接體系時時需要是冰浴條件下嗎？是否是在里阿杰反應(yīng)中有一些該注意的細(xì)節(jié)沒有注意呢？ 我實(shí)在是找不出自己是哪里出現(xiàn)問題了，希望大家給予幫助。謝謝了！ |
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天使托
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T.Shen
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2樓2011-04-23 22:52:01
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【答案】應(yīng)助回帖
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西瓜(金幣+2): 鼓勵應(yīng)助 2011-04-23 23:30:27
wzc4884(金幣+3): 2011-04-24 14:35:36
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wzc4884(金幣+3): 2011-04-24 14:35:36
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當(dāng)沒有問題的時候，怎么做都行， 一旦有問題了，就郁悶了 建議你做實(shí)驗(yàn)的時候，把對照做全了，然后才好分析哪一步出了問題 具體請參看，http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=3105782&authorid=426591 |
3樓2011-04-23 23:18:41
sfb1020
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暈暈小版主~ 姑娘你好！
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6樓2011-04-24 16:44:11
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7樓2011-04-24 23:18:59
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8樓2011-04-24 23:37:00
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