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2009227004金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
關(guān)于蛋白重組表達(dá)的問(wèn)題
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最近在做一蛋白的表達(dá)，利用已有的質(zhì)粒已經(jīng)表達(dá)出來(lái)了帶GST標(biāo)簽的蛋白，現(xiàn)在碰到了一些問(wèn)題： 1、在過(guò)谷胱甘肽親和層析柱（GS4B）分離表達(dá)蛋白時(shí)，采用了還原型谷胱甘肽（GSH）進(jìn)行洗脫，然后經(jīng)凝血酶酶切，再過(guò)谷胱甘肽親和層析柱（GS4B）時(shí)，如何去掉樣品里面的還原型谷胱甘肽（GSH）。 2、凝血酶的用量應(yīng)如何計(jì)算，購(gòu)買(mǎi)于sigma公司，其使用說(shuō)明說(shuō)也沒(méi)有具體說(shuō)明。  |
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2樓2011-05-08 15:09:51
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3樓2011-05-08 22:30:26
2009227004
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就是不用透析，把含有GSH的樣品拿去濃縮，濃到一定體積，再加入buffer再進(jìn)行濃縮，重復(fù)幾次，這樣的效果會(huì)不會(huì)比透析差，因?yàn)槲蚁雽?shí)驗(yàn)連接的快一點(diǎn)，透析時(shí)間太久了！ 單位定義是：Unit Definition: Activity is expressed in NIH units obtained by direct comparison to a NIH Thrombin Reference Standard, Lot K. The NIH assay procedure uses 0.2 ml of diluted plasma (1:1 with saline) as a substrate and 0.1 ml of albumin solution based on a modification of the method of Biggs.18 Only clotting times in the range of 15–25 seconds are used for determining thrombin activity. Optimal clotting temperature is 37 °C. |
4樓2011-05-09 10:38:12
lxj341401
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【答案】應(yīng)助回帖
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你這樣直接濃縮的話樣品和GSH都一起濃縮了，沒(méi)分開(kāi)。至于計(jì)算的問(wèn)題，這個(gè)酶我沒(méi)用過(guò)，你安裝說(shuō)明和文獻(xiàn)去計(jì)算吧。我們用的是腸激酶，都是按照酶切效果來(lái)確定比例的，不是通過(guò)計(jì)算得到比例的，選擇原則是盡可能發(fā)揮全部酶活性，并保證底物基本酶切。 |
5樓2011-05-09 10:47:59
2009227004
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6樓2011-05-09 11:04:06
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