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pigskin新蟲 (初入文壇)
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[求助]
定量PCR融解曲線問題
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所有數(shù)據(jù)都進入平臺期。 第一張圖：Jurkat cell 原模板25ul體系。后面92度有個峰。而且很高的雜峰。 第二張圖：Jurkat cell 模板稀釋三倍。七十多度二聚體減少。后面92度還是有起峰。 第三張圖：U936 cell 模板稀釋三倍。后面92度沒起峰。 第四張圖：Jurkat cell 原模板GAPDH。 第五張圖：Jurkat cell 普通PCR。 我是用SYBR green做的。在Jurkat cell中，起了雜峰，比主峰還高，以為引物特異性不好�？墒�，在U937 cell中，就沒有出現(xiàn)這個雜峰。普通PCR也就一條帶。定量后沒有跑膠。現(xiàn)在我是重新設(shè)計引物還是應(yīng)該怎么辦？請各位指導(dǎo)下。萬分感謝。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
pigskin(金幣+5): 謝謝。我也想還是換引物比較好。 2011-05-10 11:21:42
silicare(EPI+1): 2011-05-10 13:34:54
silicare(EPI+1): 2011-05-10 13:34:54
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我做過點熒光，以下幾點建議，歡迎拍磚： 1.定量出現(xiàn)雜峰后一定要跑膠看看。看下實際條帶情況。 2.我覺得你引物特異性不好，不只有二聚體還有非特異性產(chǎn)物。 這種情況下我個人建議還是換引物。 3.NTC沒做？不加模板的。在凝膠和熒光下都要做。這是必須的。 4.另外我想知道擴增曲線怎么樣？正常嗎？ 5.凝膠圖不清晰，建議用高濃度的膠。我一般不稱，就是瓊脂糖多加點，這樣分辨率會高些。 6.個人習(xí)慣問題，我建議引物不好時就不要用了。設(shè)計沒那么難。 |
2樓2011-05-10 11:19:39
pigskin
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3樓2011-05-10 11:22:30
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4樓2011-05-10 11:25:57
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5樓2011-05-10 20:06:58
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6樓2014-05-28 17:14:36
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