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該死的玻璃杯

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[求助] 為什么DNA提取總降解

目的：從一種絲狀真菌中提取DNA進(jìn)行基因組測(cè)序。

問題：使用過多種方法進(jìn)行提�。ㄒ旱心ァ⒅榇颉⒉ＡО粞心サ龋�。提取最后樣品加TE/水溶解后樣品呈乳白色，看不到通常DNA的絮狀沉淀。跑膠檢測(cè)，RNA條帶非常亮，看不到DNA條帶或者帶很弱。樣品提取之后曾使用RNase進(jìn)行處理、使用常規(guī)方法提取后過柱子回收DNA、在提取過程中在CTAB溫育之前進(jìn)行RNase的處理等。該DNA樣品含有很多RNA，需要處理掉RNA，但是其DNA對(duì)酶極其敏感，甚至沸水處理了半小時(shí)的RNase溶液加入樣品中也可以造成DNA的降解，包括過柱子的方法也造成DNA的降解。

說明：該菌含多糖較多，生長緩慢

請(qǐng)高人指教！

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1樓 2011-05-18 09:00:30

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w2boluo

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★
西瓜(金幣+3): 有經(jīng)驗(yàn)！ 2011-08-10 23:08:58

多糖含量高的組織推薦使用CTAB法。因?yàn)槎嗵呛秃怂岬男再|(zhì)接近，容易造成核酸和多糖共沉淀而被除去。

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How about the future？

8樓2011-08-10 22:56:17

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w2boluo

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+4, MolEPI+1): Good! EDTA通過螯合金屬離子，可以抑制包括DNA酶在內(nèi)的很多酶的活性。 2011-08-10 23:21:48
小丹木木: 回帖置頂 2012-02-20 15:09:29

dna容易被降解多半因?yàn)橛袃?nèi)原性的核酸酶沒有去除，解決辦法是樓上說的酚氯仿抽提，但真菌基因組較大，容易因該操作發(fā)生斷裂，也可以在最后加一步蛋白酶K消化，體系中加入較多量的EDTA，因雜質(zhì)性質(zhì)的DNA酶多數(shù)需要金屬離子做輔酶。

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How about the future？

9樓2011-08-10 23:08:22

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rioarsenal

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★
西瓜(金幣+3): Good 2011-08-11 12:10:48

1、DNA的質(zhì)量與材料的狀態(tài)有很大關(guān)系，一般應(yīng)該取柔嫩的組織。你用的絲狀真菌，是否前期培養(yǎng)時(shí)間比較長，菌絲有老化現(xiàn)象，那樣的話，dna肯定不好；
2、樓上的方法比較有效，可以加入蛋白酶。

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10樓2011-08-11 06:47:32

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追遠(yuǎn)0102

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引用回帖:

Originally posted by 該死的玻璃杯 at 2011-05-18 09:00:30:
目的：從一種絲狀真菌中提取DNA進(jìn)行基因組測(cè)序。

問題：使用過多種方法進(jìn)行提�。ㄒ旱心ァ⒅榇�、玻璃棒研磨等）。提取最后樣品加TE/水溶解后樣品呈乳白色，看不到通常DNA的絮狀沉淀。跑膠檢測(cè)，RNA條帶非常亮 ...

開學(xué)再讀研，頂起，我也想知道

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逐步適應(yīng)

2樓2011-05-18 11:18:17

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xuguanghai

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+4): Good！ 2011-05-18 11:38:19

引用回帖:

Originally posted by 該死的玻璃杯 at 2011-05-18 09:00:30:
目的：從一種絲狀真菌中提取DNA進(jìn)行基因組測(cè)序。

問題：使用過多種方法進(jìn)行提取（液氮研磨、珠打、玻璃棒研磨等）。提取最后樣品加TE/水溶解后樣品呈乳白色，看不到通常DNA的絮狀沉淀。跑膠檢測(cè)，RNA條帶非常亮 ...

用TE溶解，本來就看不到DNA吧，你跑膠都看不到DNA，那你會(huì)不會(huì)是本來就沒有DNA呢？
液氮研磨之后，用TE溶解，然后離心沉淀，去上清，用乙醇沉淀，再把沉淀跑電泳看有沒有，之后再優(yōu)化

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3樓2011-05-18 11:23:36

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springTT

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★
1949stone(金幣+1): 鼓勵(lì) 2011-05-18 14:39:16

我們實(shí)驗(yàn)室用玻璃珠法提真菌DNA，效果還不錯(cuò)。整個(gè)過程沒有用到TE溶液，在最后加入RNase 37℃消化1h。

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4樓2011-05-18 11:55:07

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★
1949stone(金幣+1): 是有些區(qū)別的 2011-05-18 14:39:37

真菌的沒有提過，這種破菌后難道不用苯酚氯仿抽提的嗎？一般不都是加苯酚氯仿抽提后，再加乙醇沉淀，然后溶解去RNA？

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在等待中涅槃重生

5樓2011-05-18 12:31:14

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lilirong2009

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我遇到的情況和樓主相似，我提大腸桿菌基因組DNA也是總是降解，用試劑盒也一樣降解，加Rnase除去RNA的結(jié)果DNA也沒有了，真不知道是什么原因

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6樓2011-07-22 22:38:47

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我也遇到這個(gè)情況了啊，一直找不到原因，不知道樓主解決了沒有呢，盼望回復(fù)~

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時(shí)間是賊，偷走一切……

7樓2011-08-10 21:27:17

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