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Extraction of Total RNA and RT-PCR Total RNA was extracted from lung and liver tissues (20mg) using RNeasy mini protection kit from QIAGEN according to the supplier·s guideline .The concentration and purity of the extracted RNA were checked spectrophotometrically by mea- suring 260/280 absorption ratios.The primer pair for ASTIV was designed in our laboratory using the Gene Fishe rprimer designing and Multialign-ment software.Usingtheforwardprimer(FP)5`-GTGTCCTATGGGTCGTGGTA-3` /reverseprimer(RP)5`-TTCTGGGCTACAGTGAAGGTA-3 (GenBank acces- sion no.X52883),the299-bp AST IV cDNA was syn-thesized.The 264-bp STa cDNA was synthesized using the primer pair FP 5`-TCCTCAAAGGATATGTTCCG- 3`/RP 5`-CAGTTCCTTCTCCATGAGAT-3` (GenBank accession no.M33329).The specificity of all primers was tested using the BLAST from the National Cen-terfo rBiotechnology Information Open Reading Frame software.cDNA synthesis from total 1 ug of liverand 2 ug of lung RNA was performed in a 50 uL reaction mixture.Concentrations of the different ingredients used followed the supplier·s guidelines. Forinterna control,500-bp cDNA of rat β-actin was synthesized from the same amount of RNA from respective sources. The prime rpair FP5`-GATGTACGTAGCCATCCA-3`/RP5`-GTGCCAACCAGACAGCA-3` for the synthesis of rat β-actin cDNA was designed in our laboratory using the software mentioned above. |
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【答案】應(yīng)助回帖
★
sltmac(金幣+1): 謝謝交流~~ 2011-05-19 08:03:03
sltmac(金幣+1): 謝謝交流~~ 2011-05-19 08:03:03
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總RNA的提取和RT-PCR 使用QIAGEN 的RNeasy mini protection 試劑盒，從20mg肺和肝組織提取總RNA。提取的RNA的難度和純度通過分光光度計(jì)測定260/280nm吸收度的比值加以確定。引物由本實(shí)驗(yàn)室使用Gene Fisher 引物設(shè)計(jì)和多重校正軟件設(shè)計(jì)。使用正向引物（FP）5`-GTGTCCTATGGGTCGTGGTA-3` / 反向引物 (RP) 5`-TTCTGGGCTACAGTGAAGGTA-3 (GenBank獲取編號：X52883),合成了299-bp 的AST IV cDNA。264-bp的 STa cDNA 通過使用如下引物對合成： FP 5`-TCCTCAAAGGATATGTTCCG- 3`/RP 5`-CAGTTCCTTCTCCATGAGAT-3` (GenBank獲取編號：M33329)。引物特異性通過國家生物信息技術(shù)中心的開放閱讀框軟件的BLAST測試。cDNA 的合成由總共1 ug的肝RNA和2 ug 的肺 RNA 在50 uL反應(yīng)混合物中進(jìn)行。各種試劑按照供應(yīng)商的指定濃度加入。作為質(zhì)控，以相同數(shù)量相應(yīng)來源的RNA合成了500-bp的大鼠β-肌動(dòng)蛋白cDNA。合成β-肌動(dòng)蛋白 cDNA的引物對FP 5`-GATGTACGTAGCCATCCA-3`/RP 5`-GTGCCAACCAGACAGCA-3`有本實(shí)驗(yàn)室以前述軟件設(shè)計(jì)。 |
2樓2011-05-19 08:00:16
8814402
至尊木蟲 (職業(yè)作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
wenjie(金幣+5, 翻譯EPI+1): 可以 2011-05-21 14:27:12
sltmac(金幣+5): 金幣是給的太少了~~~ 2011-05-27 09:44:30
wenjie(金幣+5, 翻譯EPI+1): 可以 2011-05-21 14:27:12
sltmac(金幣+5): 金幣是給的太少了~~~ 2011-05-27 09:44:30
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總RNA的提取和RT-PCR 使用QIAGEN 的RNeasy mini protection 試劑盒，從20mg肺和肝組織提取總RNA。提取的RNA的濃度和純度通過分光光度計(jì)測定260/280nm吸收度的比值加以確定。引物由本實(shí)驗(yàn)室使用Gene Fisher 引物設(shè)計(jì)和多重校正軟件設(shè)計(jì)。使用正向引物（FP）5`-GTGTCCTATGGGTCGTGGTA-3` / 反向引物 (RP) 5`-TTCTGGGCTACAGTGAAGGTA-3 (GenBank獲取編號：X52883),合成了299-bp 的AST IV cDNA。264-bp的 STa cDNA 通過使用如下引物對合成： FP 5`-TCCTCAAAGGATATGTTCCG- 3`/RP 5`-CAGTTCCTTCTCCATGAGAT-3` (GenBank獲取編號：M33329)。引物特異性通過國家生物信息技術(shù)中心的開放閱讀框軟件的BLAST測試。cDNA 的合成由總共1 ug的肝RNA和2 ug 的肺 RNA 在50 uL反應(yīng)混合物中進(jìn)行。各種試劑按照供應(yīng)商的指定濃度加入。作為質(zhì)控，以相同數(shù)量相應(yīng)來源的RNA合成了500-bp的大鼠β-肌動(dòng)蛋白cDNA。合成β-肌動(dòng)蛋白 cDNA的引物對FP 5`-GATGTACGTAGCCATCCA-3`/RP 5`-GTGCCAACCAGACAGCA-3`由本實(shí)驗(yàn)室用前述軟件設(shè)計(jì)。 |
3樓2011-05-19 09:25:58
liqi9673
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
wenjie(金幣+3): 可以 2011-05-21 14:28:17
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總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù) 根據(jù)供應(yīng)商的試劑盒上面的要求，使用RNeasy迷你保護(hù)組件，從肺和肝臟組織(20mg)中提取總RNA。通過測量吸收系數(shù)260/280來檢測提取RNA的純度和濃度。在實(shí)驗(yàn)室里，我們使用這個(gè)GF設(shè)計(jì)和Multialign-ment軟件對ASTIV引物進(jìn)行設(shè)計(jì)。使用正向引物（FP）5`-GTGTCCTATGGGTCGTGGTA-3`/反向引物 (RP) 5`-TTCTGGGCTACAGTGAAGGTA-3 (基因編號：X52883)，來合成299-bp AST IV cDNA。運(yùn)用正向引物5`-TCCTCAAAGGATATGTTCCG- 3`/RP 5`-CAGTTCCTTCTCCATGAGAT-3` (基因編號：M33329)，來合成 264-bp STa cDNA 。使用國家生物信息公開閱讀框架軟件 BLAST 測試所有引物的特性。將總量1ug肝臟的互補(bǔ)DNA和2ug肺的RNA混合為50 uL，進(jìn)行反應(yīng)。根據(jù)供應(yīng)商的要求使用不同材料的濃聚物。質(zhì)控方面，以各自來源的相同數(shù)量的RNA合成大鼠β-肌動(dòng)蛋白500-bp的cDNA。在實(shí)驗(yàn)室使用上面提到的軟件，通過對引物FP 5`-GATGTACGTAGCCATCCA-3`/RP 5`-GTGCCAACCAGACAGCA-3`進(jìn)行設(shè)計(jì)，合成大鼠β-肌動(dòng)蛋白 cDNA。 |
4樓2011-05-19 10:20:08
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5樓2011-05-23 07:49:31
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