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wenjie

雨霽

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Extraction of Total RNA and RT-PCR
Total RNA was extracted from lung and liver
tissues (20mg) using RNeasy mini protection kit
from QIAGEN according to the supplier·s guideline
.The concentration and purity of the extracted
RNA were checked spectrophotometrically by mea-
suring 260/280 absorption ratios.The primer pair
for ASTIV was designed in our laboratory using
the Gene Fishe rprimer designing and Multialign-ment software.Usingtheforwardprimer(FP)5`-GTGTCCTATGGGTCGTGGTA-3`
/reverseprimer(RP)5`-TTCTGGGCTACAGTGAAGGTA-3 (GenBank acces-
sion no.X52883),the299-bp AST IV cDNA was syn-thesized.The 264-bp STa cDNA was synthesized using the primer pair FP 5`-TCCTCAAAGGATATGTTCCG-
3`/RP 5`-CAGTTCCTTCTCCATGAGAT-3` (GenBank
accession no.M33329).The specificity of all primers was tested using the BLAST from the National Cen-terfo rBiotechnology Information Open Reading Frame
software.cDNA synthesis from total 1 ug of liverand
2 ug of lung RNA was performed in a 50 uL reaction
mixture.Concentrations of the different ingredients
used followed the supplier·s guidelines. Forinterna
control,500-bp cDNA of rat β-actin was synthesized
from the same amount of RNA from respective sources.
The prime rpair FP5`-GATGTACGTAGCCATCCA-3`/RP5`-GTGCCAACCAGACAGCA-3` for the synthesis of rat β-actin cDNA was designed in our laboratory
using the software mentioned above.

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1樓 2011-05-18 21:36:22

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8814402

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
ringzhu(金幣+2): O(∩_∩)O哈哈~ 博士哥哥要罷工咯~~ 2011-05-25 12:25:24

說(shuō)實(shí)話(huà)，樓主給的金幣太少了，還只給部分！以后自己啃把

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5樓2011-05-23 07:49:31

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【答案】應(yīng)助回帖

★
sltmac(金幣+1): 謝謝交流~~ 2011-05-19 08:03:03

總RNA的提取和RT-PCR
使用QIAGEN 的RNeasy mini protection 試劑盒，從20mg肺和肝組織提取總RNA。提取的RNA的難度和純度通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定260/280nm吸收度的比值加以確定。引物由本實(shí)驗(yàn)室使用Gene Fisher 引物設(shè)計(jì)和多重校正軟件設(shè)計(jì)。使用正向引物（FP）5`-GTGTCCTATGGGTCGTGGTA-3` / 反向引物 (RP) 5`-TTCTGGGCTACAGTGAAGGTA-3 (GenBank獲取編號(hào)：X52883),合成了299-bp 的AST IV cDNA。264-bp的 STa cDNA 通過(guò)使用如下引物對(duì)合成： FP 5`-TCCTCAAAGGATATGTTCCG- 3`/RP 5`-CAGTTCCTTCTCCATGAGAT-3` (GenBank獲取編號(hào)：M33329)。引物特異性通過(guò)國(guó)家生物信息技術(shù)中心的開(kāi)放閱讀框軟件的BLAST測(cè)試。cDNA 的合成由總共1 ug的肝RNA和2 ug 的肺 RNA 在50 uL反應(yīng)混合物中進(jìn)行。各種試劑按照供應(yīng)商的指定濃度加入。作為質(zhì)控，以相同數(shù)量相應(yīng)來(lái)源的RNA合成了500-bp的大鼠β-肌動(dòng)蛋白cDNA。合成β-肌動(dòng)蛋白 cDNA的引物對(duì)FP 5`-GATGTACGTAGCCATCCA-3`/RP 5`-GTGCCAACCAGACAGCA-3`有本實(shí)驗(yàn)室以前述軟件設(shè)計(jì)。

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2樓2011-05-19 08:00:16

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★ ★ ★
wenjie(金幣+5, 翻譯EPI+1): 可以 2011-05-21 14:27:12
sltmac(金幣+5): 金幣是給的太少了~~~ 2011-05-27 09:44:30

總RNA的提取和RT-PCR
使用QIAGEN 的RNeasy mini protection 試劑盒，從20mg肺和肝組織提取總RNA。提取的RNA的濃度和純度通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定260/280nm吸收度的比值加以確定。引物由本實(shí)驗(yàn)室使用Gene Fisher 引物設(shè)計(jì)和多重校正軟件設(shè)計(jì)。使用正向引物（FP）5`-GTGTCCTATGGGTCGTGGTA-3` / 反向引物 (RP) 5`-TTCTGGGCTACAGTGAAGGTA-3 (GenBank獲取編號(hào)：X52883),合成了299-bp 的AST IV cDNA。264-bp的 STa cDNA 通過(guò)使用如下引物對(duì)合成： FP 5`-TCCTCAAAGGATATGTTCCG- 3`/RP 5`-CAGTTCCTTCTCCATGAGAT-3` (GenBank獲取編號(hào)：M33329)。引物特異性通過(guò)國(guó)家生物信息技術(shù)中心的開(kāi)放閱讀框軟件的BLAST測(cè)試。cDNA 的合成由總共1 ug的肝RNA和2 ug 的肺 RNA 在50 uL反應(yīng)混合物中進(jìn)行。各種試劑按照供應(yīng)商的指定濃度加入。作為質(zhì)控，以相同數(shù)量相應(yīng)來(lái)源的RNA合成了500-bp的大鼠β-肌動(dòng)蛋白cDNA。合成β-肌動(dòng)蛋白 cDNA的引物對(duì)FP 5`-GATGTACGTAGCCATCCA-3`/RP 5`-GTGCCAACCAGACAGCA-3`由本實(shí)驗(yàn)室用前述軟件設(shè)計(jì)。

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3樓2011-05-19 09:25:58

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liqi9673

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wenjie(金幣+3): 可以 2011-05-21 14:28:17

總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)
根據(jù)供應(yīng)商的試劑盒上面的要求，使用RNeasy迷你保護(hù)組件，從肺和肝臟組織(20mg)中提取總RNA。通過(guò)測(cè)量吸收系數(shù)260/280來(lái)檢測(cè)提取RNA的純度和濃度。在實(shí)驗(yàn)室里，我們使用這個(gè)GF設(shè)計(jì)和Multialign-ment軟件對(duì)ASTIV引物進(jìn)行設(shè)計(jì)。使用正向引物（FP）5`-GTGTCCTATGGGTCGTGGTA-3`/反向引物 (RP) 5`-TTCTGGGCTACAGTGAAGGTA-3 (基因編號(hào)：X52883)，來(lái)合成299-bp AST IV cDNA。運(yùn)用正向引物5`-TCCTCAAAGGATATGTTCCG-
3`/RP 5`-CAGTTCCTTCTCCATGAGAT-3` (基因編號(hào)：M33329)，來(lái)合成 264-bp STa cDNA 。使用國(guó)家生物信息公開(kāi)閱讀框架軟件 BLAST 測(cè)試所有引物的特性。將總量1ug肝臟的互補(bǔ)DNA和2ug肺的RNA混合為50 uL，進(jìn)行反應(yīng)。根據(jù)供應(yīng)商的要求使用不同材料的濃聚物。質(zhì)控方面，以各自來(lái)源的相同數(shù)量的RNA合成大鼠β-肌動(dòng)蛋白500-bp的cDNA。在實(shí)驗(yàn)室使用上面提到的軟件，通過(guò)對(duì)引物FP 5`-GATGTACGTAGCCATCCA-3`/RP 5`-GTGCCAACCAGACAGCA-3`進(jìn)行設(shè)計(jì)，合成大鼠β-肌動(dòng)蛋白 cDNA。

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帶著靈魂漫步

4樓2011-05-19 10:20:08

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