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wangchunling金蟲 (小有名氣)
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[求助]
pmd18-t連不上
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| 最近在做一個(gè)基因的克隆，載體是pmd18t，菌液pcr之后電泳，總是連不上，怎么回事兒呢？按照說(shuō)明書做的…… |
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 【分子生物】EPI帖 |
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- 【求助】觀看PPS或者用迅雷下載，不久寬帶連接就會(huì)自動(dòng)斷開，之后就再連不上了
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beautybanana
木蟲 (著名寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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pMD18-T vector ligation system pMD18-T 1uL DNA template 4uL Solution I 5uL Total 10uL 將純化的PCR產(chǎn)物與T載體連接重組，16℃保溫3～4h后，全量（10uL）轉(zhuǎn)化至150uL的E.coli DH5α的感受態(tài)細(xì)胞。 (1) 將10μL連接液移入含200μL感受態(tài)細(xì)胞的1.5mL dorf管中，冰浴30-60min。 (2) 42℃水浴熱激90sec后，立即再冰浴5min。 (3) 加入300μL LB液體培養(yǎng)基，37℃ 220 rpm培養(yǎng)1-2h。 (4) 吸100μL菌液涂布含Amp/ X-Gal/ IPTG平板培養(yǎng)基的LB固體培養(yǎng)基平板， 37℃ 培養(yǎng)16－24h。 供參考，我以前做的，木問(wèn)題的。保證PCR產(chǎn)物或感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)量即可。 附上連接后的圖片供參考~ |
2樓2011-05-19 10:38:24
wangchunling
金蟲 (小有名氣)
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3樓2011-05-19 13:30:40
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4樓2014-03-28 17:01:23
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