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friya0910新蟲 (正式寫手)
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[求助]
PCR引物設(shè)計(jì)
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最近在做RT-PCR，內(nèi)參出來了，可是目的片段一直都擴(kuò)不到，是不是引物設(shè)計(jì)有問題�。恳龅鞍左w外表達(dá)，在編碼區(qū)左右設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，并加上了酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。 引物：Upper：5'catgccatggcatg AAT CAC CTG TGG TCA GGT TG 3' Lower：5'cgggatcccg G AGA TTT ACC TCA CCT TG 3' 請(qǐng)高手幫我看一下這對(duì)引物質(zhì)量如何�。课乙�55度作為退火溫度進(jìn)行PCR合適嗎？ 內(nèi)參出來了是不是就說明我的RNA模板沒問題��？?jī)?nèi)參是從別人文獻(xiàn)中找的，也不知道是什么基因，如果是rRNA的話，是不是不能說明我的總RNA中mRNA的質(zhì)量��？ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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yabxxh
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【答案】應(yīng)助回帖
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amisking(金幣+2, EPI+1): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-05-23 20:17:43
friya0910(金幣+10): 2011-05-25 09:29:43
amisking(金幣+2, EPI+1): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-05-23 20:17:43
friya0910(金幣+10): 2011-05-25 09:29:43
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你這問題問的，累得半死終于發(fā)現(xiàn)你Upper引物的酶切位點(diǎn)是NcoI。 哥們，酶切位點(diǎn)只加前面就可以了，后面的不用加。Lower引物的酶切位點(diǎn)是BamHI，同樣只加前面的保護(hù)堿基，后面的去掉。鄙人不才，修改你的引物如下： Upper：5'atccatggAATCACCTGTGGTCAGGTTG 3' Lower：5'cgcggatccGAGATTTACCTCACCTTG 3' PCR程序如下； 95 5min 95 30s 56 30s 72 1kb/min 5cycles 95 30s 60 30s 72 1kb/min 30cycles 72 10min 4 hold 如果你堅(jiān)持不想改引物，那你用以下程序試試： 95 5min 95 30s 56 30s 72 1kb/min 5cycles 95 30s 62 30s 72 1kb/min 30cycles 72 10min 4 hold 姑且一試吧，建議修改引物，好運(yùn) |
2樓2011-05-23 16:41:51
friya0910
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您好，我的酶切位點(diǎn)的保護(hù)堿基是從網(wǎng)上找的，是左右都加的呀？還有NcoI的保護(hù)堿基是CATG，為啥可以變成AT呢？ 1 ATCACTCCTC ACACCCTAAA CTCCCATTCT TACCAGCTCT CCTTCCATGG CTCGCTCCTC 61 CGCCGTCTGC TTCCTCCTCC TCCTCGCCTT CCTCATTGGC ACAGCCTCGG CA(ATCACCTG 121 TGGTCAGGTT GACTCTGACC TCACCTCCTG CCTTGGCTAT GCTAGAAAGG GCGGGGTCAT 181 CCCACCGGGC TGCTGCGCGG GTGTGAGGAC CCTTAACAAC TTAGCCAAGA CCACTCCTGA 241 TCGCCAGACT GCATGCAACT GCCTCAAGTC TCTGGTGAAC CCCAGCCTTG GCCTCAATGC 301 TGCTATCGTC GCCGGCATCC CCGGCAAGTG CGGCGTCAAC ATCCCCTACC CGATCAGCAT 361 GCAGACTGAT TGCAACAAGG TGAGGTAA)AT CTCCGTATGG AGCCTACTGC TGGTACTGCG 421 CATCTGCTGG TTTTATTATT AGTACTACTT GGTCGGAGCG GCGGGAATAA AAGACGCTTC 481 ATTCACCAAT GTTTGGTTTG TGAACCAGTT TGCGGTGTTG TAGTCTTCTG TTTCAGCTAA 541 TGATGTTACA TTTTAGACTC TCATTATCTT CGATGGTGGG GTCTGTAGCA TTGTAATAAA 601 ATTATGTTAT GTTATGAAAT TTGAGTTTTT TCCTTGGTAA AAAAAAAAAA 這是cDNA序列，括號(hào)里是我要表達(dá)的成熟蛋白，酶切位點(diǎn)是上面說的兩個(gè)，我要做蛋白體外表達(dá)，但是這段序列前半部分CG含量高，后半部分AT含量高，我在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候遇到了很大的麻煩，請(qǐng)高人指點(diǎn)一下小女子，本人初涉分子，真是郁悶至極啊！ |
3樓2011-05-25 09:45:38
yabxxh
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1949stone(金幣+2): 高手 高手 高高手 2011-05-25 11:58:06
1949stone(金幣+2): 高手 高手 高高手 2011-05-25 11:58:06
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首先，酶切位點(diǎn)的保護(hù)堿基只是為了保證內(nèi)切酶準(zhǔn)確識(shí)別并切斷酶切位點(diǎn)用的，你在網(wǎng)上查到的是neb網(wǎng)站的好多年前的建議保護(hù)堿基。 但是在實(shí)際操作中，后面的部分我們是不加保護(hù)堿基的，為什么呢，因?yàn)槟愕钠涡蛄芯涂梢哉J(rèn)為是保護(hù)堿基，而且保護(hù)堿基不是一定要嚴(yán)格按照neb推薦表上的堿基和數(shù)目的，我們有時(shí)候根據(jù)需要，會(huì)進(jìn)行調(diào)節(jié)，比如為了平衡GC含量，會(huì)把推薦表上的AT全換成GC，或者反之。保護(hù)堿基的數(shù)目也是如此，有時(shí)候?yàn)榱似胶忾L(zhǎng)度也會(huì)增減堿基數(shù)目。所以你可以把保護(hù)堿基看成是你引物序列確定之后的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，而并非固定數(shù)目和堿基的。 其次，內(nèi)切酶發(fā)展到今天，以fermentas為代表的一批公司已經(jīng)可以做出所有內(nèi)切酶在同一buffer中的酶切活性都是100，所以我一般在前面加兩個(gè)堿基做保護(hù)堿基，這兩個(gè)堿基的數(shù)目和是什么由我的引物來決定。 最后，你說你的前半部分GC高，后半部分GC低，我看了一下，GC是有點(diǎn)高，而且呈M型，不存在你說的情況。所以建議按普通引物設(shè)計(jì)就好，采用TAKARA的prime star酶，用prime star的GC buffer試一下，應(yīng)該效果會(huì)比較好。 好運(yùn) |
4樓2011-05-25 10:04:00
friya0910
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6樓2011-05-25 10:20:31
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