 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 9 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1006 | 回復(fù): 8 | ||||
| 本帖產(chǎn)生 1 個(gè) MolEPI ，點(diǎn)擊這里進(jìn)行查看 | ||||
friya0910新蟲 (正式寫手)
|
[求助]
PCR引物設(shè)計(jì)
|
|||
|
最近在做RT-PCR，內(nèi)參出來了，可是目的片段一直都擴(kuò)不到，是不是引物設(shè)計(jì)有問題��？要做蛋白體外表達(dá)，在編碼區(qū)左右設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，并加上了酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。 引物：Upper：5'catgccatggcatg AAT CAC CTG TGG TCA GGT TG 3' Lower：5'cgggatcccg G AGA TTT ACC TCA CCT TG 3' 請(qǐng)高手幫我看一下這對(duì)引物質(zhì)量如何��？我以55度作為退火溫度進(jìn)行PCR合適嗎？ 內(nèi)參出來了是不是就說明我的RNA模板沒問題啊？?jī)?nèi)參是從別人文獻(xiàn)中找的，也不知道是什么基因，如果是rRNA的話，是不是不能說明我的總RNA中mRNA的質(zhì)量啊？ |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 【分子生物】EPI帖 |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有201人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
湖北師范大學(xué)招調(diào)劑啦
已經(jīng)有4人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 幫忙評(píng)價(jià)一下PCR引物
已經(jīng)有11人回復(fù)
- PCR引物設(shè)計(jì)的問題
已經(jīng)有8人回復(fù)
- RT-PCR引物設(shè)計(jì)
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 如何設(shè)計(jì)重疊延伸PCR引物
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 【求助/交流】引物設(shè)計(jì)信息如此，touchdownPCR如何設(shè)計(jì)？
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 【求助/交流】pCR引物設(shè)計(jì)的詳細(xì)規(guī)則
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 【求助/交流】多重PCR引物設(shè)計(jì)
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 【求助/交流】PCR引物設(shè)計(jì)出來了，但酶切之后電泳沒條帶啊
已經(jīng)有18人回復(fù)
yabxxh
木蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 14
- 應(yīng)助: 22 (小學(xué)生)
- 貴賓: 0.005
- 金幣: 2238
- 散金: 98
- 紅花: 9
- 帖子: 465
- 在線: 88.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 157001
- 注冊(cè): 2006-01-05
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
amisking(金幣+2, EPI+1): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-05-23 20:17:43
friya0910(金幣+10): 2011-05-25 09:29:43
amisking(金幣+2, EPI+1): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-05-23 20:17:43
friya0910(金幣+10): 2011-05-25 09:29:43
|
你這問題問的，累得半死終于發(fā)現(xiàn)你Upper引物的酶切位點(diǎn)是NcoI。 哥們，酶切位點(diǎn)只加前面就可以了，后面的不用加。Lower引物的酶切位點(diǎn)是BamHI，同樣只加前面的保護(hù)堿基，后面的去掉。鄙人不才，修改你的引物如下： Upper：5'atccatggAATCACCTGTGGTCAGGTTG 3' Lower：5'cgcggatccGAGATTTACCTCACCTTG 3' PCR程序如下； 95 5min 95 30s 56 30s 72 1kb/min 5cycles 95 30s 60 30s 72 1kb/min 30cycles 72 10min 4 hold 如果你堅(jiān)持不想改引物，那你用以下程序試試： 95 5min 95 30s 56 30s 72 1kb/min 5cycles 95 30s 62 30s 72 1kb/min 30cycles 72 10min 4 hold 姑且一試吧，建議修改引物，好運(yùn) |
2樓2011-05-23 16:41:51
friya0910
新蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 4 (幼兒園)
- 金幣: 19.4
- 散金: 360
- 帖子: 401
- 在線: 77.4小時(shí)
- 蟲號(hào): 1073675
- 注冊(cè): 2010-08-12
- 專業(yè): 作物分子育種
|
您好，我的酶切位點(diǎn)的保護(hù)堿基是從網(wǎng)上找的，是左右都加的呀？還有NcoI的保護(hù)堿基是CATG，為啥可以變成AT呢？ 1 ATCACTCCTC ACACCCTAAA CTCCCATTCT TACCAGCTCT CCTTCCATGG CTCGCTCCTC 61 CGCCGTCTGC TTCCTCCTCC TCCTCGCCTT CCTCATTGGC ACAGCCTCGG CA(ATCACCTG 121 TGGTCAGGTT GACTCTGACC TCACCTCCTG CCTTGGCTAT GCTAGAAAGG GCGGGGTCAT 181 CCCACCGGGC TGCTGCGCGG GTGTGAGGAC CCTTAACAAC TTAGCCAAGA CCACTCCTGA 241 TCGCCAGACT GCATGCAACT GCCTCAAGTC TCTGGTGAAC CCCAGCCTTG GCCTCAATGC 301 TGCTATCGTC GCCGGCATCC CCGGCAAGTG CGGCGTCAAC ATCCCCTACC CGATCAGCAT 361 GCAGACTGAT TGCAACAAGG TGAGGTAA)AT CTCCGTATGG AGCCTACTGC TGGTACTGCG 421 CATCTGCTGG TTTTATTATT AGTACTACTT GGTCGGAGCG GCGGGAATAA AAGACGCTTC 481 ATTCACCAAT GTTTGGTTTG TGAACCAGTT TGCGGTGTTG TAGTCTTCTG TTTCAGCTAA 541 TGATGTTACA TTTTAGACTC TCATTATCTT CGATGGTGGG GTCTGTAGCA TTGTAATAAA 601 ATTATGTTAT GTTATGAAAT TTGAGTTTTT TCCTTGGTAA AAAAAAAAAA 這是cDNA序列，括號(hào)里是我要表達(dá)的成熟蛋白，酶切位點(diǎn)是上面說的兩個(gè)，我要做蛋白體外表達(dá)，但是這段序列前半部分CG含量高，后半部分AT含量高，我在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候遇到了很大的麻煩，請(qǐng)高人指點(diǎn)一下小女子，本人初涉分子，真是郁悶至極啊！ |
3樓2011-05-25 09:45:38
yabxxh
木蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 14
- 應(yīng)助: 22 (小學(xué)生)
- 貴賓: 0.005
- 金幣: 2238
- 散金: 98
- 紅花: 9
- 帖子: 465
- 在線: 88.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 157001
- 注冊(cè): 2006-01-05
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
★ ★
1949stone(金幣+2): 高手 高手 高高手 2011-05-25 11:58:06
1949stone(金幣+2): 高手 高手 高高手 2011-05-25 11:58:06
|
首先，酶切位點(diǎn)的保護(hù)堿基只是為了保證內(nèi)切酶準(zhǔn)確識(shí)別并切斷酶切位點(diǎn)用的，你在網(wǎng)上查到的是neb網(wǎng)站的好多年前的建議保護(hù)堿基。 但是在實(shí)際操作中，后面的部分我們是不加保護(hù)堿基的，為什么呢，因?yàn)槟愕钠涡蛄芯涂梢哉J(rèn)為是保護(hù)堿基，而且保護(hù)堿基不是一定要嚴(yán)格按照neb推薦表上的堿基和數(shù)目的，我們有時(shí)候根據(jù)需要，會(huì)進(jìn)行調(diào)節(jié)，比如為了平衡GC含量，會(huì)把推薦表上的AT全換成GC，或者反之。保護(hù)堿基的數(shù)目也是如此，有時(shí)候?yàn)榱似胶忾L(zhǎng)度也會(huì)增減堿基數(shù)目。所以你可以把保護(hù)堿基看成是你引物序列確定之后的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，而并非固定數(shù)目和堿基的。 其次，內(nèi)切酶發(fā)展到今天，以fermentas為代表的一批公司已經(jīng)可以做出所有內(nèi)切酶在同一buffer中的酶切活性都是100，所以我一般在前面加兩個(gè)堿基做保護(hù)堿基，這兩個(gè)堿基的數(shù)目和是什么由我的引物來決定。 最后，你說你的前半部分GC高，后半部分GC低，我看了一下，GC是有點(diǎn)高，而且呈M型，不存在你說的情況。所以建議按普通引物設(shè)計(jì)就好，采用TAKARA的prime star酶，用prime star的GC buffer試一下，應(yīng)該效果會(huì)比較好。 好運(yùn) |
4樓2011-05-25 10:04:00
friya0910
新蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 4 (幼兒園)
- 金幣: 19.4
- 散金: 360
- 帖子: 401
- 在線: 77.4小時(shí)
- 蟲號(hào): 1073675
- 注冊(cè): 2010-08-12
- 專業(yè): 作物分子育種
5樓2011-05-25 10:12:59
yabxxh
木蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 14
- 應(yīng)助: 22 (小學(xué)生)
- 貴賓: 0.005
- 金幣: 2238
- 散金: 98
- 紅花: 9
- 帖子: 465
- 在線: 88.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 157001
- 注冊(cè): 2006-01-05
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
6樓2011-05-25 10:20:31
friya0910
新蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 4 (幼兒園)
- 金幣: 19.4
- 散金: 360
- 帖子: 401
- 在線: 77.4小時(shí)
- 蟲號(hào): 1073675
- 注冊(cè): 2010-08-12
- 專業(yè): 作物分子育種
7樓2011-05-25 10:25:32
yabxxh
木蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 14
- 應(yīng)助: 22 (小學(xué)生)
- 貴賓: 0.005
- 金幣: 2238
- 散金: 98
- 紅花: 9
- 帖子: 465
- 在線: 88.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 157001
- 注冊(cè): 2006-01-05
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
8樓2011-05-25 10:27:48
dreamswing
木蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1797.1
- 散金: 4
- 紅花: 1
- 帖子: 77
- 在線: 77.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 1278543
- 注冊(cè): 2011-04-26
- 性別: GG
- 專業(yè): 微生物藥物
9樓2011-06-27 10:19:38
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 friya0910 的主題更新
| 9 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 322求調(diào)劑 +10 | 舊吢 2026-03-24 | 10/500 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿浙江大學(xué)工科動(dòng)力工程370,數(shù)一121,專業(yè)課135，現(xiàn)在能去哪里 +3 | 080700調(diào)劑 2026-03-30 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 287求調(diào)劑 +17 | land xuxu 2026-03-26 | 17/850 |
|
|
|
[考研] 293分求調(diào)劑，外語為俄語 +5 | 加一一九 2026-03-31 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿西交288化工專碩求調(diào)劑 +4 | 好運(yùn)好運(yùn)接接 2026-03-24 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 哈爾濱工業(yè)大學(xué)材料與化工專碩378求調(diào)劑 +3 | 塔比烏斯 2026-03-30 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 279求調(diào)劑 +12 | j的立方 2026-03-29 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 生物學(xué)學(xué)碩，一志愿湖南大學(xué)，初試成績(jī)338 +7 | YYYYYNNNNN 2026-03-26 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 085600 286分 材料求調(diào)劑 +11 | 麻辣魷魚 2026-03-27 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 293求調(diào)劑 +3 | 末未mm 2026-03-30 | 5/250 |
|
|
|
[基金申請(qǐng)] 面上5B能上會(huì)嗎？ +7 | redcom 2026-03-29 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +4 | QiMing7 2026-03-25 | 5/250 |
|
|
|
[考研]
 一志愿武漢理工，總分321，英一數(shù)二，求老師收留。
+11
|
nnnnnnn5 2026-03-25 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 329求調(diào)劑 +10 | 鈕恩雪 2026-03-25 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 279求調(diào)劑 +4 | 蝶舞輕繞 2026-03-29 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 壓國(guó)家一區(qū)線，求導(dǎo)師收留，有恩必謝！ +7 | 迷人的哈哈 2026-03-28 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 272求調(diào)劑 +7 | 腳滑的守法公民 2026-03-27 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿鄭大085600，310分求調(diào)劑 +5 | 李瀟可 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 341求調(diào)劑 +7 | 青檸檬1 2026-03-26 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院-光纖傳感課題組招生-中國(guó)科學(xué)院大學(xué)、深圳理工大學(xué)聯(lián)培 +5 | YangTyu1 2026-03-26 | 5/250 |
|