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qyqy512銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
PCR沒有結(jié)果
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| 本人要做構(gòu)建表達(dá)載體，可是目的條帶p不出來，引物是根據(jù)NCBI上已經(jīng)公布的序列設(shè)計(jì)的編碼區(qū)，說明引物應(yīng)該是沒問題的；模板可以p出其它基因，唯獨(dú)目的基因p不出來，溫度梯度40-70℃都試過了，模板梯度也試過了，都出不來，只有一次在57℃時(shí)出來了非常淡的條帶，50ul體系電泳就跟平時(shí)5ul電泳結(jié)果差不多，割膠回收之后連接沒成功，之后再怎么也p不出來了。請(qǐng)高手指教�。。『芗卑。。�！ |
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cdl007
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【答案】應(yīng)助回帖
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amisking(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-05-25 19:54:06
qyqy512(金幣+1): hsp基因，2000bp，引物是老師給設(shè)計(jì)的，自己也不知道，pcr體系是酶0.8ul、引物各1ul、dntp4ul、buffer5ul、模板1ul，總共50ul體系。用得是艾德萊的taq，艾德萊的高保真酶也用過，也p不出來 2011-05-26 08:22:21
amisking(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-05-25 19:54:06
qyqy512(金幣+1): hsp基因，2000bp，引物是老師給設(shè)計(jì)的，自己也不知道，pcr體系是酶0.8ul、引物各1ul、dntp4ul、buffer5ul、模板1ul，總共50ul體系。用得是艾德萊的taq，艾德萊的高保真酶也用過，也p不出來 2011-05-26 08:22:21
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建議以后問問題要專業(yè)一點(diǎn)，像您這樣只簡(jiǎn)單描述一下的話，沒有辦法得到有質(zhì)量的回復(fù) 最好有圖、數(shù)據(jù) 哪個(gè)基因，擴(kuò)多少bp？引物序列？pcr體系？什么酶？ |
2樓2011-05-25 19:52:36
空谷幽風(fēng)
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3樓2011-05-25 20:13:15
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4樓2011-05-25 20:47:17
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我也想問同樣的問題，最近在做RT和gene walking，這個(gè)基因根據(jù)NCBI上的序列設(shè)計(jì)引物，RT擴(kuò)增出來過一次，測(cè)序有突變，有多個(gè)終止子出現(xiàn)，因?yàn)楹竺嬉獙?duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行亞細(xì)胞定位，所以要想再再，但是之后就再也沒有擴(kuò)出來過，換過最近推薦比較好用的酶，同時(shí)換過引物之后，RT擴(kuò)出800多的片段，本來是應(yīng)該2900多，還是往下游做了一下，測(cè)序跟公布的cDNA 比對(duì)，這個(gè)前后完全匹配，就是中間完全缺失了2000多，望高人指點(diǎn)。 基因組長(zhǎng)距離擴(kuò)增，想先拿到一部分序列，再做walking，一步一步拿到完整的基因組序列，長(zhǎng)距離擴(kuò)增時(shí)，拿到一部分序列，約3000bp，但是之后walking一直沒有結(jié)果，只是在點(diǎn)樣孔出有東西，剛開始懷疑模板量多了，之后減少了模板量，但還是沒有結(jié)果 |
5樓2011-06-07 16:24:21
wuzuobin125
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6樓2011-06-07 16:51:41
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