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qyqy512銅蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
PCR沒(méi)有結(jié)果
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| 本人要做構(gòu)建表達(dá)載體，可是目的條帶p不出來(lái)，引物是根據(jù)NCBI上已經(jīng)公布的序列設(shè)計(jì)的編碼區(qū)，說(shuō)明引物應(yīng)該是沒(méi)問(wèn)題的；模板可以p出其它基因，唯獨(dú)目的基因p不出來(lái)，溫度梯度40-70℃都試過(guò)了，模板梯度也試過(guò)了，都出不來(lái)，只有一次在57℃時(shí)出來(lái)了非常淡的條帶，50ul體系電泳就跟平時(shí)5ul電泳結(jié)果差不多，割膠回收之后連接沒(méi)成功，之后再怎么也p不出來(lái)了。請(qǐng)高手指教�。�！很急�。。�！ |
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wuzuobin125
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6樓2011-06-07 16:51:41
cdl007
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【答案】應(yīng)助回帖
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amisking(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-05-25 19:54:06
qyqy512(金幣+1): hsp基因，2000bp，引物是老師給設(shè)計(jì)的，自己也不知道，pcr體系是酶0.8ul、引物各1ul、dntp4ul、buffer5ul、模板1ul，總共50ul體系。用得是艾德萊的taq，艾德萊的高保真酶也用過(guò)，也p不出來(lái) 2011-05-26 08:22:21
amisking(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-05-25 19:54:06
qyqy512(金幣+1): hsp基因，2000bp，引物是老師給設(shè)計(jì)的，自己也不知道，pcr體系是酶0.8ul、引物各1ul、dntp4ul、buffer5ul、模板1ul，總共50ul體系。用得是艾德萊的taq，艾德萊的高保真酶也用過(guò)，也p不出來(lái) 2011-05-26 08:22:21
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建議以后問(wèn)問(wèn)題要專(zhuān)業(yè)一點(diǎn)，像您這樣只簡(jiǎn)單描述一下的話(huà)，沒(méi)有辦法得到有質(zhì)量的回復(fù) 最好有圖、數(shù)據(jù) 哪個(gè)基因，擴(kuò)多少bp？引物序列？pcr體系？什么酶？ |
2樓2011-05-25 19:52:36
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3樓2011-05-25 20:13:15
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【答案】應(yīng)助回帖
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1.PCR本來(lái)就是一個(gè)變數(shù)很大的反應(yīng)，首先你的質(zhì)粒載體構(gòu)建好了么？檢查好了確保目的基因的正確性 2.按理說(shuō)能你能P出淺帶來(lái)，引物應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題，要不再檢查一下，看看參數(shù)什么的，這樣也好定你的溫度梯度 3.循環(huán)數(shù)適當(dāng)調(diào)整一下，有的時(shí)候就是因?yàn)檠h(huán)數(shù)少而P不出來(lái) 4.還有就是你目的條帶的堿基數(shù)，有的時(shí)候太長(zhǎng)了也不好P的 |
4樓2011-05-25 20:47:17
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