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lot2006木蟲 (正式寫手)
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[求助]
重金在線求助：鏈霉菌液體種子液4℃冰箱保存時間
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液體微生物種子液一般在4℃冰箱保存多久后活力下降嚴重？鏈霉菌液體種子液4℃冰箱保存35 h后進一級種子罐影響是否嚴重？在種子罐發(fā)酵調(diào)控過程中可采取那些方法減小這些影響？ 急，在線求助，謝謝！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
lot2006(金幣+10): 非常感謝，已經(jīng)進罐了，明天才能看出生長情況，祈禱中…… 2011-05-26 18:21:09
rainwander(EPI+1): 鼓勵交流 2011-05-28 17:27:24
rainwander(EPI+1): 鼓勵交流 2011-05-28 17:27:24
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（1） 液體微生物種子液一般在4℃冰箱保存一周后活力應(yīng)該影響不大，要是比較懶，保存半年都還能活化，但是活力會下降，我以前做實驗，把種子液放了1個月還在用，嘿嘿 （2）鏈霉菌液體種子液4℃冰箱保存35 h后進一級種子罐影響應(yīng)該不大，但要看你種子液之前活化的情況，因為即使在4度，菌株也是生長的。 （3）具體怎么在種子罐發(fā)酵調(diào)控過程中可采取措施減小影響，我沒搞過，你這么短時間，應(yīng)該沒事的。 在有問題，在交流，僅供參考，菌株之間可能還有差別。 |
2樓2011-05-26 11:30:30
hanguorui110
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【答案】應(yīng)助回帖
lot2006(金幣+8): 謝謝熱情回復(fù)，不過貌似回答稍稍有那么點跑題 2011-05-26 18:22:02
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應(yīng)該不會吧 均在四度里保存只是不繁殖了而已，菌的形態(tài)和自身沒發(fā)生改變，三十五個小時肯定不會有影響的，放心用。哈哈我們的酵母菌放四度3~4天都能用。 順便再給你一點保藏菌種的方法， 甘油冷凍保藏法 本方法適合于中、長期菌種保藏，保藏時間一般為2-4年左右。 （1）用火焰滅菌的接種環(huán)取斜面菌種在平皿上劃線分離單菌落。 （2）平皿倒置于30℃或37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24-48小時，至單菌落的大小為3mm左右。 （3）挑取一個單菌落，接種于一個裝50mL（LB）的300mL三角瓶中30℃或37℃振蕩培養(yǎng)10-15小時，至菌密度OD600為1.0-1.5。 （4）用火焰滅菌的接種環(huán)取少量種子液，涂片后，作革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)，及是否有雜菌。 （5）按30%甘油：種子液為1：1（V/V）的量加入無菌甘油， 混合后分裝至事先滅菌的菌種保存管（1-2mL/管），-70℃或液氮保存。 冷凍干燥保藏法 �。�1）準備安瓿管用于冷凍干燥菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形狀可用長頸球形底的，亦稱淚滴型安瓿管，大小要求外徑6-7.5mm，長105mm，球部直徑9-11mm，壁厚0.6-1.2mm。也可用沒有球部的管狀安瓿管。塞好棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃滅菌30分鐘，備用。 �。�2）準備菌種，用冷凍干燥法保藏的菌種，其保藏期可達數(shù)年至十數(shù)年，為了在許多年后不出差錯，故所用菌種要特別注意其純度，即不能有雜菌污染，然后在最適培養(yǎng)基中用最適溫度培養(yǎng)，使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物。細菌和酵母的菌齡要求超過對數(shù)生長期，若用對數(shù)生長期的菌種進行保藏，其存活率反而降低。一般，細菌要求24—48小時的培養(yǎng)物；酵母需培養(yǎng)3天；形成孢子的微生物則宜保存孢子；放線菌與絲狀真菌則培養(yǎng)7-10天。 �。�3）制備菌懸液與分裝以細菌斜面為例，用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中，制成濃菌液，每支安瓿管分裝0.2ml。 �。�4）冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售，價值昂貴，此處介紹的是簡易方法與裝置，可達到同樣的目的。 將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍，無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰（固體CO2）酒精液或干冰丙酮液，溫度可達-70℃。將安瓿管插入冷凍劑，只需冷凍4-5分鐘，即可使懸液結(jié)冰。 �。�5）真空干燥為在真空干燥時使樣品保持凍結(jié)狀態(tài)，需準備冷凍槽，槽內(nèi)放碎冰塊與食鹽，混合均勻，可冷至-15℃。裝置儀器，安瓿管放入冷凍槽中的干燥瓶內(nèi)。 抽氣一般若在30分鐘內(nèi)能達到93.3Pa（0.7mmHg）真空度時，則干燥物不致熔化，以后再繼續(xù)抽氣，幾小時內(nèi)，肉眼可觀察到被干燥物已趨干燥，一般抽到真空度26.7Pa（0.2mmHg），保持壓力6-8小時即可。 �。�6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管繼續(xù)抽氣，約10分鐘即可達到26.7Pa（0.2mmHg）。于真空狀態(tài)下，以煤氣噴燈的細火焰在安瓿管頸中央進行封口。封口以后，保存于冰箱或室溫暗處。 此法為菌種保藏方法中最有效的方法之一，對一般生活力強的微生物及其孢子以及無芽胞菌都適用，即使對一些很難保存的致病菌，如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存。適用于菌種長期保存，一般可保存數(shù)年至十余年，但設(shè)備和操作都比較復(fù)雜。 濾紙保藏法 �。�1）將濾紙剪成0.5×1.2cm的小條，裝入0．6×8cm的安瓿管中，每管1-2張，塞以棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃滅菌30分鐘。 �。�2）將需要保存的菌種，在適宜的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使充分生長。 �。�3）取滅菌脫脂牛乳1-2ml滴加在滅菌培養(yǎng)皿或試管內(nèi)，取數(shù)環(huán)菌苔在牛乳內(nèi)混勻，制成濃懸液。 �。�4）用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內(nèi)，使其吸飽，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。 �。�5）將安瓿管放入內(nèi)有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中，用真空泵抽氣至干。 （6）將棉花塞入管內(nèi)，用火焰熔封，保存于低溫下。 �。�7）需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時，可將安瓿管口在火焰上燒熱，滴一滴冷水在燒熱的部位，使玻璃破裂，再用鑷子敲掉口端的玻璃，待安瓿管開啟后，取出濾紙，放入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。 細菌、酵母菌、絲狀真菌均可用此法保藏，前兩者可保藏2年左右，有些絲狀真菌甚至可保藏14-17年之久。此法較液氮、冷凍干燥法簡便，不需要特殊設(shè)備。 濾紙保藏法 �。�1）將濾紙剪成0.5×1.2cm的小條，裝入0．6×8cm的安瓿管中，每管1-2張，塞以棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃滅菌30分鐘。 （2）將需要保存的菌種，在適宜的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使充分生長。 �。�3）取滅菌脫脂牛乳1-2ml滴加在滅菌培養(yǎng)皿或試管內(nèi)，取數(shù)環(huán)菌苔在牛乳內(nèi)混勻，制成濃懸液。 �。�4）用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內(nèi)，使其吸飽，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。 �。�5）將安瓿管放入內(nèi)有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中，用真空泵抽氣至干。 �。�6）將棉花塞入管內(nèi)，用火焰熔封，保存于低溫下。 �。�7）需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時，可將安瓿管口在火焰上燒熱，滴一滴冷水在燒熱的部位，使玻璃破裂，再用鑷子敲掉口端的玻璃，待安瓿管開啟后，取出濾紙，放入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。 細菌、酵母菌、絲狀真菌均可用此法保藏，前兩者可保藏2年左右，有些絲狀真菌甚至可保藏14-17年之久。此法較液氮、冷凍干燥法簡便，不需要特殊設(shè)備。 沙土保藏法 �。�1）取河沙加入10％稀鹽酸，加熱煮沸30分鐘，以去除其中的有機質(zhì)。 （2）倒去酸水，用自來水沖洗至中性。 （3）烘干，用40目篩子過篩，以去掉粗顆粒，備用。 �。�4）另取非耕作層的不含腐植質(zhì)的瘦黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。 �。�5）烘干，碾碎，通過100目篩子過篩，以去除粗顆粒。 �。�6）按一份黃土、三份沙的比例（或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）摻合均勻，裝入10×100mm的小試管或安瓿管中，每管裝1g左右，塞上棉塞，進行滅菌，烘干。 （7）抽樣進行無菌檢查，每10支沙土管抽一支，將沙土倒入肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48小時，若仍有雜菌，則需全部重新滅菌，再作無菌試驗，直至證明無菌，方可備用。 �。�8）選擇培養(yǎng)成熟的（一般指孢子層生長豐滿的，營養(yǎng)細胞用此法效果不好）優(yōu)良菌種，以無菌水洗下，制成孢子懸液。 �。�9）于每支沙土管中加入約0.5ml（一般以剛剛使沙土潤濕為宜）孢子懸液，以接種針拌勻。 （10）放入真空干燥器內(nèi)，用真空泵抽干水分，抽干時間越短越好，務(wù)使在12小時內(nèi)抽干。 �。�11）每10支抽取一支，用接種環(huán)取出少數(shù)沙粒，接種于斜面培養(yǎng)基上，進行培養(yǎng)，觀察生長情況和有無雜菌生長，如出現(xiàn)雜菌或菌落數(shù)很少或根本不長，則說明制作的沙土管有問題，尚須進一步抽樣檢查。 �。�12）若經(jīng)檢查沒有問題，用火焰熔封管口，放冰箱或室內(nèi)干燥處保存。每半年檢查一次活力和雜菌情況。 �。�13）需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時，取沙土少許移入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。 此法多用于能產(chǎn)生孢子的微生物如霉菌、放線菌，因此在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣，效果亦好，但應(yīng)用于營養(yǎng)細胞效果不佳。 斜面低溫保藏法 將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長后，棉塞部分用油紙包扎好，移至2-8℃的冰箱中保藏。 保藏時間依微生物的種類而有不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細菌保存2-4個月，移種一次。酵母菌兩個月，移種一次。細菌最好每月移種一次。 此法為實驗室和工廠菌種室常用的保藏法，優(yōu)點是操作簡單，使用方便，不需特殊設(shè)備，能隨時檢查所保藏的菌株是否死亡、變異與污染雜菌等。缺點是容易變異，因為培養(yǎng)基的物理、化學特性不是嚴格恒定的，屢次傳代會使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀；污染雜菌的機會亦較多。 液氮冷凍保藏法 �。�1）準備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受溫度突然變化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1.2mm液體的。 �。�2）加保護劑與滅菌保存細菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細胞時，則將空安瓿管塞上棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃滅菌15分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內(nèi)預(yù)先加入保護劑如10％的甘油蒸餾水溶液或10％二甲亞砜蒸餾水溶液，加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限，而后再用1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌15分鐘。 （3）接入菌種將菌種用10％的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管；霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內(nèi)切取菌落圓塊，放入含有保護劑的安瓿管內(nèi)，然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。 （4）凍結(jié)再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結(jié)至-30℃。若細胞急劇冷凍，則在細胞內(nèi)會形成冰的結(jié)晶，因而降低存活率。 （5）保藏經(jīng)凍結(jié)至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器的小圓筒內(nèi)，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi)。液氮保藏器內(nèi)的氣相為-150℃，液態(tài)氮內(nèi)為-196℃。 �。�6）恢復(fù)培養(yǎng)保藏的菌種需要用時，將安瓿管取出，立即放入38-40℃的水浴中進行急劇解凍，直到全部融化為止。再打開安瓿管，將內(nèi)容物移入適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 此法除適宜于一般微生物的保藏外，對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動物細胞均可長期保藏，而且性狀不變異。缺點是需要特殊設(shè)備。 液體石蠟保藏法 �。�1）將液體石蠟分裝于三角燒瓶內(nèi)，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，1.05kg/cm2，121.3℃滅菌30分鐘，然后放在40℃溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉，備用。 �。�2）將需要保藏的菌種，在最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得到健壯的菌體或孢子。 �。�3）用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1cm為準，使菌種與空氣隔絕。 �。�4）將試管直立，置低溫或室溫下保存（有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時間還要長）。 此法實用而效果好。霉菌、放線菌、芽孢細菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1-2年，一般無芽孢細菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌，在37℃溫箱內(nèi)，亦可保藏3個月之久。此法的優(yōu)點是制作簡單，不需特殊設(shè)備，且不需經(jīng)常移種。缺點是保存時必須直立放置，所占位置較大，同時也不便攜帶。從液體石蠟下面取培養(yǎng)物移種后，接種環(huán)在火焰上燒灼時，培養(yǎng)物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺，應(yīng)特別注意。 |
3樓2011-05-26 12:16:30
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