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[求助]
求助PCR老是跑不出條帶
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我跑PCR跑了好幾次，只有一次出過條帶。試劑都是新買的，加樣也沒有錯(cuò)。不知哪里出了問題。引物用的16s RDNA通用引物5’-TACCTTGTTACGACTT- 3’ 和5’-AGAGTTTGATCATGGC-3，復(fù)性溫度用的40度。（曾做過42,44,46,48,50的溫度梯度也沒有條帶）我把那個(gè)唯一出條帶的電泳圖和總DNA也發(fā)上來了。求高手指點(diǎn)！必謝！還有幾天就畢業(yè)了，還沒有做完實(shí)驗(yàn)，很著急，求大師指點(diǎn)！ 是不是復(fù)性溫度不夠好？文獻(xiàn)上用的比較長的F27和R1492引物是57度，我那兩條引物的Tm分別是48和44，因?yàn)樽鎏荻纫矝]出結(jié)果，就自己設(shè)了個(gè)40度。 不知表述清楚沒有，謝謝了。 [ Last edited by 1949stone on 2011-6-2 at 15:56 ] |
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 【分子生物】EPI帖 |
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2樓2011-06-02 14:02:45
★
1949stone(金幣+1): 的確有很多疑問啊 2011-06-02 14:55:51
1949stone(金幣+1): 的確有很多疑問啊 2011-06-02 14:55:51
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3樓2011-06-02 14:11:19
4樓2011-06-02 14:27:18
天使托
專家顧問 (職業(yè)作家)
T.Shen
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【答案】應(yīng)助回帖
1949stone(EPI+1): 厲害 2011-06-02 14:55:03
一枝清秀8611(金幣+3): 復(fù)性溫度不是應(yīng)該比Tm低4-5度么？ 2011-06-04 13:36:51
一枝清秀8611(金幣+3): 復(fù)性溫度不是應(yīng)該比Tm低4-5度么？ 2011-06-04 13:36:51
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5樓2011-06-02 14:53:45
★ ★
dhd997(金幣+2): good 2011-06-04 19:05:01
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6樓2011-06-02 15:25:19
7樓2011-06-02 17:20:54
d1emon
銅蟲 (初入文壇)
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8樓2011-06-02 18:06:32
tianhuijuan
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9樓2011-06-02 18:56:30
周夢怡
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
一枝清秀8611(金幣+2): 恩，也許是有些多了。你的57 度是F27和R1492引物吧 2011-06-04 13:44:39
dhd997(金幣+2): good 2011-06-04 19:05:28
一枝清秀8611(金幣+2): 恩，也許是有些多了。你的57 度是F27和R1492引物吧 2011-06-04 13:44:39
dhd997(金幣+2): good 2011-06-04 19:05:28
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模板太多了 很可能那16S的刷子是來源你模板 我也碰到這情況 當(dāng)時(shí)我是20加1 后來改為20加0.5 就出現(xiàn)帶了 溫度的話 建議你做個(gè)溫度梯度 我用的溫度是57度 還有 一定要確保你提的DNA夠純 不存在PCR抑制劑  祝你好運(yùn) 這PCR有時(shí)真看運(yùn)氣 |
10樓2011-06-04 13:05:51
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