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tianhuijuan

金蟲 (小有名氣)

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[求助] nested-PCR 怎樣提高特異性

最近一直在做nest-PCR，產(chǎn)物特異性一直上不去。很是糾結(jié)：第一次p出的產(chǎn)物切膠回收后，稀釋5倍取1微升做模板二次PCR,結(jié)果和第一次差不多，沒有出現(xiàn)條帶，仍是smear，幾乎和第一次P的結(jié)果一樣。
第一次P用的模板是提取的總RNA轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA后，與Adaptor（之前實驗室用的能成功的序列）鏈接。（除根據(jù)Adaptor設(shè)計的兩條引物外的兩條引物是由三個物種的同源性手動設(shè)計的。）
兩次PCR都進(jìn)行了退火溫度和時間，及循環(huán)數(shù)的優(yōu)化，也進(jìn)行過TD-PCR（間隔1度 2度都試過），結(jié)果仍變化不大。
PS：模板在與Adaptor連接前用其他引物驗證過，有條帶。
1. 連接后有smear，應(yīng)該算是連接成功了吧？
2. 試劑盒Taq & Pfu 的都試過，結(jié)果是一樣。那應(yīng)該是引物的問題？但是不可能引物都出問題��？

懇求各位蟲蟲幫忙啦.

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1樓 2011-06-02 18:13:57

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

智能機(jī)器人

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