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YongfengWang鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
real time PCR能測(cè)定基因組內(nèi)某一基因的拷貝數(shù)嗎？
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| real time PCR能測(cè)定基因組內(nèi)某一基因的拷貝數(shù)嗎？我怎么認(rèn)為只能檢測(cè)模版濃度？如果能測(cè)定基因的拷貝數(shù)，原理是什么，幫忙解釋一下，坐等，謝謝 |
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西瓜
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對(duì)您的看法持保留態(tài)度哦。 如果是兩個(gè)不同的基因組，可以按照您的方法，把其中一個(gè)基因組的拷貝數(shù)看成1，另一個(gè)基因組與其進(jìn)行比較（用比較Ct值法或者標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法都可以）。但是樓主這里只有一個(gè)未知拷貝數(shù)的基因組，他的問(wèn)題就等于是有待測(cè)樣品，但是沒(méi)有可以用于比較的標(biāo)準(zhǔn)品。 一般這種情況，應(yīng)該先把目的基因克隆到質(zhì)粒里面，然后用測(cè)OD260的方法可以測(cè)質(zhì)粒濃度（也就知道了拷貝數(shù)，即copies/uL），再把質(zhì)粒梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品，與樣品基因組一起做實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR），梯度稀釋的質(zhì)�？梢宰龀鰳�(biāo)準(zhǔn)曲線，這樣就能知道樣品基因組的拷貝數(shù)了。 質(zhì)�？截悢�(shù)可以這樣計(jì)算： 質(zhì)粒濃度（ng/uL）=OD260×50×稀釋倍數(shù) 質(zhì)粒分子量=堿基數(shù)×324 質(zhì)�？截悢�(shù)（copies/uL）=質(zhì)粒濃度（ng/uL）÷質(zhì)粒分子量×6×10^14（10的14次方） 個(gè)人意見(jiàn)，歡迎各位不吝賜教  |
3樓2011-06-09 23:37:05
beautybanana
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【答案】應(yīng)助回帖
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YongfengWang(金幣+2): 好像忽然開(kāi)竅了，測(cè)定時(shí)應(yīng)該先測(cè)定基因組模版的質(zhì)量濃度和含參照基因而不含目的基因的基因組模版質(zhì)量濃度，我問(wèn)題里說(shuō)的應(yīng)該是摩爾濃度，謝謝啦 2011-06-09 22:08:01
西瓜(金幣+3): 鼓勵(lì)交流，費(fèi)心了哦。 2011-06-09 23:20:49
YongfengWang(金幣+2): 好像忽然開(kāi)竅了，測(cè)定時(shí)應(yīng)該先測(cè)定基因組模版的質(zhì)量濃度和含參照基因而不含目的基因的基因組模版質(zhì)量濃度，我問(wèn)題里說(shuō)的應(yīng)該是摩爾濃度，謝謝啦 2011-06-09 22:08:01
西瓜(金幣+3): 鼓勵(lì)交流，費(fèi)心了哦。 2011-06-09 23:20:49
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這個(gè)先要把基因組提取出來(lái)，然后把基因組做模板，對(duì)那個(gè)基因進(jìn)行RT-PCR，如果所研究的某一基因的所有拷貝數(shù)都包含在基因組內(nèi)的話，那么就可以確定原始的拷貝數(shù)，當(dāng)然需要制作一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的，（可以把那段基因當(dāng)做定量的工具，先要準(zhǔn)確定量好，濃度大一點(diǎn)的，就是說(shuō)先定量一個(gè)ng級(jí)以上的標(biāo)準(zhǔn)模板，可以用紫外分光光度計(jì)或是nanodrop等儀器能夠檢測(cè)出的，然后梯度稀釋，這樣先制作成一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的曲線）這樣可以根據(jù)RT-PCR的擴(kuò)增Ct值代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線里去求出拷貝數(shù)，當(dāng)然模板要全部包含在基因組內(nèi)。不知道我說(shuō)的對(duì)不對(duì)，也就是你所說(shuō)的實(shí)際上就是檢測(cè)模板的濃度。 參看下RT-PCR原理看下啊 |
2樓2011-06-09 21:36:20
beautybanana
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4樓2011-06-10 08:56:23
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5樓2012-08-31 09:21:03
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