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[交流]
求助：關(guān)于基因表達(dá)中調(diào)控蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的連接和表達(dá)
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已知條件：目前通過異源表達(dá)了一段基因A，得到蛋白活性，這段基因A的原始來源的下游有兩個反向ORF，分別執(zhí)行了調(diào)控和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能，現(xiàn)已證明了這兩個ORF的存在對A的活性有明顯的提高作用，所以想吧這兩個反向ORF 也異源表達(dá)來看看是否在異源宿主里對A亦有促進(jìn)作用。 問題： （1）這兩個反向ORF 和A是同基因簇來源，緊密相連，而且二者有重疊區(qū)域，那么我在做異源表達(dá)的時候是直接把這兩個反向ORF 一次性的擴(kuò)增出來表達(dá)呢？還是應(yīng)該分別擴(kuò)增，然后連接起來再去表達(dá)？ （2）和A同基因簇來源的這兩個ORF 同A的轉(zhuǎn)錄翻譯反向相反，那么在異源表達(dá)是否應(yīng)該也是反向表達(dá)，還是應(yīng)該調(diào)整順序后在進(jìn)行表達(dá)？ （3）A基因和它下游的兩個ORF 是同基因簇來源的，那么，是否意味著A的上游一些比如啟動原件對于兩個反向的ORF 也有作用，還是這兩個反向的ORF 的下游也有某些啟動原件，那么這些啟動原件如何進(jìn)行分析？在做異源表達(dá)的時候是否也應(yīng)該加上去？ 愿意和壇子你的各位進(jìn)行廣泛交流！ |
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3樓2011-06-09 23:44:53
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
西瓜(金幣+5, EPI+1): Good! 2011-06-09 23:46:50
ottolzm(金幣+3): 2011-06-10 11:51:44
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
西瓜(金幣+5, EPI+1): Good! 2011-06-09 23:46:50
ottolzm(金幣+3): 2011-06-10 11:51:44
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已知條件：目前通過異源表達(dá)了一段基因A，得到蛋白活性，這段基因A的原始來源的下游有兩個反向ORF，分別執(zhí)行了調(diào)控和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能，現(xiàn)已證明了這兩個ORF的存在對A的活性有明顯的提高作用，所以想吧這兩個反向ORF 也異源表達(dá)來看看是否在異源宿主里對A亦有促進(jìn)作用。 問題： （1）這兩個反向ORF 和A是同基因簇來源，緊密相連，而且二者有重疊區(qū)域，那么我在做異源表達(dá)的時候是直接把這兩個反向ORF 一次性的擴(kuò)增出來表達(dá)呢？還是應(yīng)該分別擴(kuò)增，然后連接起來再去表達(dá)？ ++++++++++++++++++++一這兩個反向ORF位于下游,且執(zhí)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能,那么有兩種可能,一個是反向ORF表達(dá)出的蛋白結(jié)合在A上游序列，起到轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，那么你可能要在A基因上游找找有沒有這樣的結(jié)合位點(diǎn)，可以通過生物信息學(xué)方法預(yù)測，如果有，那么這個調(diào)控區(qū)也得一塊擴(kuò)增到異源宿主里，另外一個是這兩個反向ORF有助于A基因MRNA的穩(wěn)定，或者說是有助于核糖體和A基因的結(jié)合，那么這個情況，一起擴(kuò)增ABC這三個就可以了，啟動子用宿主的。 （2）和A同基因簇來源的這兩個ORF 同A的轉(zhuǎn)錄翻譯反向相反，那么在異源表達(dá)是否應(yīng)該也是反向表達(dá)，還是應(yīng)該調(diào)整順序后在進(jìn)行表達(dá)？ ++++++++++++++++++++++++++++++這個方向更本不用調(diào)整，當(dāng)然，你可以嘗試調(diào)整后，做做這個實驗 （3）A基因和它下游的兩個ORF 是同基因簇來源的，那么，是否意味著A的上游一些比如啟動原件對于兩個反向的ORF 也有作用， +++++++++++++++++這個有可能，但是你可以用在以遠(yuǎn)宿主菌表達(dá)ABC，在以遠(yuǎn)宿主菌表達(dá)BC比較兩種情況BC的活性，來初步解決這個問題，當(dāng)然，正如第一個問題所說，在A的上游也可能存在BC的調(diào)控位點(diǎn) 還是這兩個反向的ORF 的下游也有某些啟動原件，那么這些啟動原件如何進(jìn)行分析？在做異源表達(dá)的時候是否也應(yīng)該加上去？ +++++++++++++++某基因下游一般很少有該基因的啟動元件，下游調(diào)控比較復(fù)雜，一般不用考慮這一步。 因為樓主給的信息，可以解釋的很多，只能給出個大概我的看法，希望大家指正。 [ Last edited by 嚙風(fēng) on 2011-6-9 at 23:10 ] |
2樓2011-06-09 23:07:22
4樓2011-06-10 11:55:14
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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樓主，你好！我現(xiàn)在也遇到了跟你同樣的問題，特向你求助！ 非常期待能得到你的回復(fù)！ 已知條件：現(xiàn)已知某原核生物中基因組上有三個基因A,B和C參與合成某種酶（其中B和C預(yù)測是分子伴侶蛋白，對A合成的蛋白進(jìn)行加工）�，F(xiàn)在我想在原核生物中異源表達(dá)這三個蛋白，但是它們在原始來源的基因組上，A和B方向相同，而C與A,B方向相反。且B和C之間序列之間有重疊區(qū)域。那么我在做異源表達(dá)的時候是直接把這三個基因一次性的擴(kuò)增出來去表達(dá)呢？還是應(yīng)該分別擴(kuò)增，然后連接起來再去表達(dá)？ （1）如果是把這三個基因一次性的擴(kuò)增出來去表達(dá)，我就打算在A基因上游加一個啟動子，那這個啟動子對C有作用嗎（因為基因C與A的方向是相反的）？或者能不能在A基因上游加一個啟動子的同時，在C的下游加一個反向的啟動子（此時C基因及其啟動子反向互補(bǔ)區(qū)是同方向的）？ （2）如果把三個基因分別擴(kuò)增，是不是會破壞B和C基因重疊區(qū)域可能存在的某種調(diào)控作用？ 非常期待你的回復(fù)！十分感謝！ |
6樓2013-05-28 21:51:08
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