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[交流]
求助：關于基因表達中調控蛋白和轉錄調控蛋白的連接和表達
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已知條件：目前通過異源表達了一段基因A，得到蛋白活性，這段基因A的原始來源的下游有兩個反向ORF，分別執(zhí)行了調控和轉錄調控的功能，現(xiàn)已證明了這兩個ORF的存在對A的活性有明顯的提高作用，所以想吧這兩個反向ORF 也異源表達來看看是否在異源宿主里對A亦有促進作用。 問題： （1）這兩個反向ORF 和A是同基因簇來源，緊密相連，而且二者有重疊區(qū)域，那么我在做異源表達的時候是直接把這兩個反向ORF 一次性的擴增出來表達呢？還是應該分別擴增，然后連接起來再去表達？ （2）和A同基因簇來源的這兩個ORF 同A的轉錄翻譯反向相反，那么在異源表達是否應該也是反向表達，還是應該調整順序后在進行表達？ （3）A基因和它下游的兩個ORF 是同基因簇來源的，那么，是否意味著A的上游一些比如啟動原件對于兩個反向的ORF 也有作用，還是這兩個反向的ORF 的下游也有某些啟動原件，那么這些啟動原件如何進行分析？在做異源表達的時候是否也應該加上去？ 愿意和壇子你的各位進行廣泛交流！ |
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4樓2011-06-10 11:55:14
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
西瓜(金幣+5, EPI+1): Good! 2011-06-09 23:46:50
ottolzm(金幣+3): 2011-06-10 11:51:44
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
西瓜(金幣+5, EPI+1): Good! 2011-06-09 23:46:50
ottolzm(金幣+3): 2011-06-10 11:51:44
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已知條件：目前通過異源表達了一段基因A，得到蛋白活性，這段基因A的原始來源的下游有兩個反向ORF，分別執(zhí)行了調控和轉錄調控的功能，現(xiàn)已證明了這兩個ORF的存在對A的活性有明顯的提高作用，所以想吧這兩個反向ORF 也異源表達來看看是否在異源宿主里對A亦有促進作用。 問題： （1）這兩個反向ORF 和A是同基因簇來源，緊密相連，而且二者有重疊區(qū)域，那么我在做異源表達的時候是直接把這兩個反向ORF 一次性的擴增出來表達呢？還是應該分別擴增，然后連接起來再去表達？ ++++++++++++++++++++一這兩個反向ORF位于下游,且執(zhí)行轉錄調控功能,那么有兩種可能,一個是反向ORF表達出的蛋白結合在A上游序列，起到轉錄調控作用，那么你可能要在A基因上游找找有沒有這樣的結合位點，可以通過生物信息學方法預測，如果有，那么這個調控區(qū)也得一塊擴增到異源宿主里，另外一個是這兩個反向ORF有助于A基因MRNA的穩(wěn)定，或者說是有助于核糖體和A基因的結合，那么這個情況，一起擴增ABC這三個就可以了，啟動子用宿主的。 （2）和A同基因簇來源的這兩個ORF 同A的轉錄翻譯反向相反，那么在異源表達是否應該也是反向表達，還是應該調整順序后在進行表達？ ++++++++++++++++++++++++++++++這個方向更本不用調整，當然，你可以嘗試調整后，做做這個實驗 （3）A基因和它下游的兩個ORF 是同基因簇來源的，那么，是否意味著A的上游一些比如啟動原件對于兩個反向的ORF 也有作用， +++++++++++++++++這個有可能，但是你可以用在以遠宿主菌表達ABC，在以遠宿主菌表達BC比較兩種情況BC的活性，來初步解決這個問題，當然，正如第一個問題所說，在A的上游也可能存在BC的調控位點 還是這兩個反向的ORF 的下游也有某些啟動原件，那么這些啟動原件如何進行分析？在做異源表達的時候是否也應該加上去？ +++++++++++++++某基因下游一般很少有該基因的啟動元件，下游調控比較復雜，一般不用考慮這一步。 因為樓主給的信息，可以解釋的很多，只能給出個大概我的看法，希望大家指正。 [ Last edited by 嚙風 on 2011-6-9 at 23:10 ] |
2樓2011-06-09 23:07:22
3樓2011-06-09 23:44:53
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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樓主，你好！我現(xiàn)在也遇到了跟你同樣的問題，特向你求助！ 非常期待能得到你的回復！ 已知條件：現(xiàn)已知某原核生物中基因組上有三個基因A,B和C參與合成某種酶（其中B和C預測是分子伴侶蛋白，對A合成的蛋白進行加工）。現(xiàn)在我想在原核生物中異源表達這三個蛋白，但是它們在原始來源的基因組上，A和B方向相同，而C與A,B方向相反。且B和C之間序列之間有重疊區(qū)域。那么我在做異源表達的時候是直接把這三個基因一次性的擴增出來去表達呢？還是應該分別擴增，然后連接起來再去表達？ （1）如果是把這三個基因一次性的擴增出來去表達，我就打算在A基因上游加一個啟動子，那這個啟動子對C有作用嗎（因為基因C與A的方向是相反的）？或者能不能在A基因上游加一個啟動子的同時，在C的下游加一個反向的啟動子（此時C基因及其啟動子反向互補區(qū)是同方向的）？ （2）如果把三個基因分別擴增，是不是會破壞B和C基因重疊區(qū)域可能存在的某種調控作用？ 非常期待你的回復！十分感謝！ |
6樓2013-05-28 21:51:08
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