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p120933799金蟲 (小有名氣)
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[求助]
DNA溶解小問
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| 我用CTAB方法提取真菌DNA，基本上是嚴(yán)格按照操作，可最后加TE后總有不溶解透明物質(zhì)，在65℃下也不溶解，請問為何？如何可避免，以往也遇到很多這種情況， |
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【答案】應(yīng)助回帖
p120933799(金幣+5): 謝謝，很詳細(xì)啊 2011-06-14 08:41:41
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采用冷凍研磨CTAB法提取樣品基因組DNA。 （1）從斜面培養(yǎng)基中接入一定量的孢子至液體種子培養(yǎng)基中180rpm，28℃培養(yǎng)2天，用7mL的離心管離心收集菌體，用無菌水洗滌后充分晾干至-70℃冰箱保存。 （2）取0.5g干燥的菌絲體放入研缽中，用液氮磨碎至粉狀，轉(zhuǎn)移至7mLeppendorf離心管中。 （3）加入2mL 65℃預(yù)熱的2×CTAB 抽提液，顛倒混勻，65℃保溫30min，每隔數(shù)分鐘溫和混勻一次。 （4）加入2mL的氯仿/異戊醇（24：1），輕緩顛倒混勻，室溫靜置5～10min ，10000rpm離心5min。 （5）取上清約2mL轉(zhuǎn)至另一干凈的eppendorf離心管中（注意不要吸出有機相），加入200uL 65℃預(yù)熱的CTAB/ NaCl 溶液，輕緩顛倒混勻。 （6）加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1）抽提液，混勻，10000rpm離心5min。 （7）取上清700uL至另一干凈的eppendorf離心管中（注意不要吸出有機相），加入等體積的 CTAB沉淀液，顛倒混勻，65℃保溫30min。 （8）4℃，5000rpm離心5min。 （9）倒去上清，用濾紙吸干殘液，加入500uL 高鹽TE緩沖液重懸沉淀，65℃保溫30min，直至完全溶解。 （10）加入300 uL的異丙醇沉淀核酸，充分混勻，4℃，10000rpm離心15min。 （11）倒去上清，用80%乙醇洗滌沉淀，用濾紙吸干殘液，在超凈工作臺中室溫下自然干燥。 （12）加入100uL含RNA酶的TE緩沖液重懸，42℃水浴30min。 以0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA大小及提取質(zhì)量；紫外分光光度計法檢測DNA純度（將DNA稀釋100倍后分別測OD260和OD280，并計算OD260/ OD280的比值） 這是我做的步驟，溶解不了是不是最后搞的太干了~這種情況應(yīng)該是很少的~ |
2樓2011-06-13 19:20:52
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CTAB法太繁瑣了，看我的 2.4.14.1真菌總DNA的提取 （1）接種菌株至液體培養(yǎng)基中，28℃，180rpm振蕩培養(yǎng)3天； （2）用滅菌紗布過濾，并壓干菌體； （3）將菌絲體倒入研缽（滅菌并預(yù)冷），迅速倒入液氮，研磨至粉末狀； （4）將粉末移至1.5mL的EP管中，加入600µL真菌提取液； （5）加等體積苯酚/氯仿，輕輕倒轉(zhuǎn)混合，10000rpm離心10min； （6）取400µL上清液移入新的1.5mlLEP管，重復(fù)步驟（5）； （7）取上清液，加入兩倍體積無水乙醇，-20℃放置30min； （8）10000rpm 離心10min，75%乙醇洗沉淀2次，真空干燥； （9）以20µL 1×TE 溶解沉淀； （10）電泳檢測總DNA的濃度。 （5）DNA抽提液的配置 表 2.5 DNA抽提液的配置 成分 濃度 NaCl 200mmol/L EDTA-Na2 4mmol/L SDS 2% Tris-HCl(pH=8.0) 100mmol/L |
3樓2011-06-14 21:33:42
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