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[求助]
兩個基因融合不起來
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現(xiàn)在在做基因的融合表達(dá)，把A和B兩個基因用overlapPCR的方法融合起來。A B兩個基因都用PCR的方法擴(kuò)出來了，大小與預(yù)期的大小一致，并且都是用的保真酶。但overlapPCR就是做不好，兩個基因怎么也融合不到一起，都做了好幾遍了，我用的是PFU酶，2kb/min,融合基因大概2500bp,是不是酶的問題啊，擴(kuò)增速度太慢了？ 還有就是我的A基因是直接從基因組中擴(kuò)增的，B基因是從構(gòu)建好的PQE載體中擴(kuò)增的。是不是必須要從構(gòu)建好的載體中擴(kuò)增��？哪位高手指點下啊 |
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lxj341401
至尊木蟲 (著名寫手)
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3樓2011-06-12 20:04:47
西瓜
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
da_da(金幣+2): 2011-06-13 18:35:28
da_da(金幣+1): 2011-06-15 10:06:41
dhd997(金幣+5): good 2011-07-04 18:04:43
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dhd997(金幣+5): good 2011-07-04 18:04:43
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基因從哪里擴(kuò)增出來的沒關(guān)系的。 Overlaping PCR的產(chǎn)物一般很少的，條帶很淡，你的圖最好上來看看。我做的一般上10ul的樣，能看到淡淡的條帶就ok，有雜帶也ok，因為我們還會再拿這個產(chǎn)物作為模板再進(jìn)行一次擴(kuò)增。 我印象中Pfu酶的擴(kuò)增速度比Taq會慢很多，Taq一般是1kb/min，Pfu是600bp/min左右，樓主用的哪家的Pfu酶？2kb/min很快啊。 |
2樓2011-06-12 17:45:06
4樓2011-06-12 20:43:16
5樓2011-06-12 20:45:41
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