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兩個(gè)基因融合不起來
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現(xiàn)在在做基因的融合表達(dá)，把A和B兩個(gè)基因用overlapPCR的方法融合起來。A B兩個(gè)基因都用PCR的方法擴(kuò)出來了，大小與預(yù)期的大小一致，并且都是用的保真酶。但overlapPCR就是做不好，兩個(gè)基因怎么也融合不到一起，都做了好幾遍了，我用的是PFU酶，2kb/min,融合基因大概2500bp,是不是酶的問題啊，擴(kuò)增速度太慢了？ 還有就是我的A基因是直接從基因組中擴(kuò)增的，B基因是從構(gòu)建好的PQE載體中擴(kuò)增的。是不是必須要從構(gòu)建好的載體中擴(kuò)增��？哪位高手指點(diǎn)下啊 |
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西瓜
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
da_da(金幣+2): 2011-06-13 18:35:28
da_da(金幣+1): 2011-06-15 10:06:41
dhd997(金幣+5): good 2011-07-04 18:04:43
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da_da(金幣+1): 2011-06-15 10:06:41
dhd997(金幣+5): good 2011-07-04 18:04:43
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基因從哪里擴(kuò)增出來的沒關(guān)系的。 Overlaping PCR的產(chǎn)物一般很少的，條帶很淡，你的圖最好上來看看。我做的一般上10ul的樣，能看到淡淡的條帶就ok，有雜帶也ok，因?yàn)槲覀冞�會(huì)再拿這個(gè)產(chǎn)物作為模板再進(jìn)行一次擴(kuò)增。 我印象中Pfu酶的擴(kuò)增速度比Taq會(huì)慢很多，Taq一般是1kb/min，Pfu是600bp/min左右，樓主用的哪家的Pfu酶？2kb/min很快啊。 |
2樓2011-06-12 17:45:06
lxj341401
至尊木蟲 (著名寫手)
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3樓2011-06-12 20:04:47
4樓2011-06-12 20:43:16
5樓2011-06-12 20:45:41
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
da_da(金幣+5): 2011-06-13 18:35:40
da_da(金幣+2): 2011-06-15 10:07:06
dhd997(金幣+5): good 2011-07-04 18:05:06
da_da(金幣+5): 2011-06-13 18:35:40
da_da(金幣+2): 2011-06-15 10:07:06
dhd997(金幣+5): good 2011-07-04 18:05:06
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有的PFU可以到達(dá)樓主說的合成效率，我就用過這樣的酶 不過他的活性比Taq要差，樓主擴(kuò)增2.5Kb的目的帶有點(diǎn)長，鑒于這種情況：建議樓主將A片段放到某個(gè)平端克隆載體（你是用PFU擴(kuò)增的吧）上，再用A/B兩個(gè)克隆載體做模板，這樣就會(huì)非常容易；另外擴(kuò)增的時(shí)候，模板量不能過多，大概30ng/50ul比例就夠了（不知道你兩個(gè)載體的大小，具體情況還需調(diào)整）；如果效果還不理想，在上面的基礎(chǔ)上在降低退火溫度3度左右，延長延伸時(shí)間到3min。 Bless you！ |
6樓2011-06-12 21:42:43
空谷幽風(fēng)
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7樓2011-06-13 15:28:11
8樓2011-06-13 18:21:57
9樓2011-06-13 18:24:44
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我的A B兩個(gè)片段都是用Pfu擴(kuò)增的，每次做的都是20倍稀釋，然后再做的OverlapPCR，酶的效率是2min/kb我上面寫錯(cuò)了。我的PCR體系如下 組成成分 體積（µL） 10×Pfu Buffer with MgSO4 5 dNTP（2.5mM） 5 上游引物（10µM） 2 下游引物（10µM） 2 模板A(回收產(chǎn)物20倍稀釋) 1 模板B(回收產(chǎn)物20倍稀釋) 1 Pfu DNA Polymerase（1.25-2.5u/µL）1 滅菌去離子水 33 反應(yīng)總體積 50 PCR反應(yīng)程序?yàn)? 95 ℃預(yù)變性5 min ;95 ℃ 30 s ,58 ℃30 s ,72 ℃ 5min10 ,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min ;4 ℃60min 。 幫忙看看吧 真的挺著急的 謝謝�。�！ |
10樓2011-06-13 18:31:31
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