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[求助]
兩個基因融合不起來
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現(xiàn)在在做基因的融合表達，把A和B兩個基因用overlapPCR的方法融合起來。A B兩個基因都用PCR的方法擴出來了，大小與預(yù)期的大小一致，并且都是用的保真酶。但overlapPCR就是做不好，兩個基因怎么也融合不到一起，都做了好幾遍了，我用的是PFU酶，2kb/min,融合基因大概2500bp,是不是酶的問題啊，擴增速度太慢了？ 還有就是我的A基因是直接從基因組中擴增的，B基因是從構(gòu)建好的PQE載體中擴增的。是不是必須要從構(gòu)建好的載體中擴增啊？哪位高手指點下啊 |
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空谷幽風(fēng)
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7樓2011-06-13 15:28:11
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【答案】應(yīng)助回帖
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da_da(金幣+2): 2011-06-13 18:35:28
da_da(金幣+1): 2011-06-15 10:06:41
dhd997(金幣+5): good 2011-07-04 18:04:43
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dhd997(金幣+5): good 2011-07-04 18:04:43
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基因從哪里擴增出來的沒關(guān)系的。 Overlaping PCR的產(chǎn)物一般很少的，條帶很淡，你的圖最好上來看看。我做的一般上10ul的樣，能看到淡淡的條帶就ok，有雜帶也ok，因為我們還會再拿這個產(chǎn)物作為模板再進行一次擴增。 我印象中Pfu酶的擴增速度比Taq會慢很多，Taq一般是1kb/min，Pfu是600bp/min左右，樓主用的哪家的Pfu酶？2kb/min很快啊。 |
2樓2011-06-12 17:45:06
lxj341401
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3樓2011-06-12 20:04:47
4樓2011-06-12 20:43:16
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