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pumpkin236

鐵蟲 (小有名氣)

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各位前輩
我最近開始做基因沉默，沉默的是NIH3T3細(xì)胞系的sep15基因，但是用RT-PCR檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默效率為0，不知道是怎么回事，所以請(qǐng)大家?guī)臀铱匆幌?br /> 1 siRNA序列的選擇
我參考的是一篇文獻(xiàn)，下面
The following Stealth RNA interference (RNAi) duplexes (Invitrogen, Carlsbad, CA) were used: Sep15, UCCUGAGCGAGAAGUUGGAACGCAU;
文獻(xiàn)給的是sep15的RNA單鏈，是不就是給的miRNA序列，（看到一個(gè)帖子介紹了miRNA和siRNA的區(qū)別，說(shuō)miRNA是單鏈，siRNA是雙鏈）？

我直接按堿基配對(duì)原則，配對(duì)成了雙鏈的RNA。當(dāng)做siRNA。讓公司合成
但是現(xiàn)在沉默效率為0.不知道是本身siRNA序列合成錯(cuò)誤還是其他原因
2 使用的轉(zhuǎn)染試劑是lipo2000
步驟如下
①① 以合適的密度接種細(xì)胞至6孔培養(yǎng)板中，在轉(zhuǎn)染的前一直用10％新生小牛血清而無(wú)雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到80％融合時(shí)，換用無(wú)血清無(wú)雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)并進(jìn)行轉(zhuǎn)染；
②② 對(duì)于需要轉(zhuǎn)染的每孔細(xì)胞，用250μl的DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基來(lái)稀釋5μl的siRNA引物（含siRNA引物的量為100pmol）；
③③ 用250μl的DMEM無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基來(lái)稀釋5μl的Lipofectamine2000；
④④ 一旦Lipofectamine2000被DMEM稀釋，5分鐘內(nèi)將稀釋的siRNA引物（步驟2）和稀釋的lipofectamine2000（步驟3）混合均勻，在在室溫下孵育20min促使siRNA引物與lipofectamine2000混合物的形成；
⑤⑤ 孵育完成后，直接往每孔中加入siRNA引物與lipofectamine2000混合物500μl，補(bǔ)足無(wú)血清培無(wú)雙抗培養(yǎng)基至2000μl，并輕輕搖晃培養(yǎng)板使其混勻；
⑥⑥ 轉(zhuǎn)染24h后，可檢測(cè)目的蛋白質(zhì)的表達(dá)或加藥進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題
1轉(zhuǎn)染前細(xì)胞狀態(tài)較好，但是轉(zhuǎn)染后6h去觀察，發(fā)現(xiàn)有部分細(xì)胞死亡，而且背景有很多小黑點(diǎn)，24h觀察，有很多成團(tuán)的漂浮物。死細(xì)胞不像，如果是染菌了，但是我操作已經(jīng)很小心，實(shí)驗(yàn)也重復(fù)了三次，三次都是到轉(zhuǎn)染后才出發(fā)好多漂浮物。

2用RT-PCR檢驗(yàn)，沉默效率為0，郁悶死了。大家檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率是用wb，還是PCR

3大家都用的什么轉(zhuǎn)染試劑

4 不知道是不是我的siRNA序列選擇錯(cuò)誤。siRNA可以用miRNA按照堿基配對(duì)方法合成不

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1樓 2011-06-14 17:25:11

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silicare

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【答案】應(yīng)助回帖

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lstt09nk(金幣+5): 你會(huì)的還挺多的么 2011-06-16 22:00:16
pumpkin236(金幣+1): 2011-06-26 20:22:25
pumpkin236(金幣+1): 2011-06-26 20:22:26

siRNA不好做，對(duì)于新手可以選擇更好控制的shRNA，shRNA是雙鏈DNA構(gòu)建載體，比較好操作

干擾序列一般要選3段，不建議自己設(shè)計(jì)，成功率低，你可以到NCBI 的探針庫(kù)去找，或者查文獻(xiàn)找現(xiàn)成的

lipo2000的毒性眾所周知，漂細(xì)胞也在所難免
ps lipo的假貨很多，最好原裝

至于檢測(cè)，RT-PCR需要做熒光定量才行，WB也可以，不過(guò)時(shí)間點(diǎn)一定要控制好，早了不干擾，晚了干擾過(guò)了又回復(fù)了，畢竟他不能整合

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3樓2011-06-15 08:25:36

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rb

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lstt09nk(金幣+2): 感謝參與 2011-06-16 22:00:48
pumpkin236(金幣+1): 2011-06-17 13:13:47
pumpkin236(金幣+1): 2011-06-26 20:22:32

細(xì)胞死亡太多，可能和轉(zhuǎn)染試劑以及細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)，你應(yīng)該會(huì)做一個(gè)陰性的FAM標(biāo)記的轉(zhuǎn)染對(duì)照，看一下在這個(gè)過(guò)程中轉(zhuǎn)染效率以及siRNA是否穩(wěn)定，另最好做一個(gè)beta－actin siRNA的陽(yáng)性對(duì)照。如果是rt－PCR檢測(cè)的最好是24-48小時(shí)抽提，如果做wb，可以48-72小時(shí)抽提。
很久不玩了，只有這些建議。

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寢室樓的大爺、大媽都是哲學(xué)家，他們每天都在思考人類最根本的三個(gè)問(wèn)題：你是誰(shuí)？你從哪兒來(lái)？要去哪兒？

4樓2011-06-15 10:21:08

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zhuqiushi

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lstt09nk(金幣+2): 熱心 2011-06-16 21:59:56
pumpkin236(金幣+2): 2011-06-23 16:19:07
pumpkin236(金幣+1): 2011-06-26 20:22:17

給樓主一個(gè)做RNA干擾的公司（武漢晶賽）的網(wǎng)址吧，上面有一些做RNA干擾的原理方法：http://www.genesil.com/knowledge.asp?kid=29
另外，我們以前做RNA干擾的時(shí)候都是至少設(shè)計(jì)兩條siRNA；再另外，你們做RT-PCR的時(shí)候有沒(méi)有先做一個(gè)時(shí)間梯度的摸索，其他還木有想到（好久木有做了）

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日子就是問(wèn)題疊著問(wèn)題，要挺胸抬頭去面對(duì)

2樓2011-06-15 07:22:11

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rb

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引用回帖:

Originally posted by silicare at 2011-06-15 08:25:36:
siRNA不好做，對(duì)于新手可以選擇更好控制的shRNA，shRNA是雙鏈DNA構(gòu)建載體，比較好操作

干擾序列一般要選3段，不建議自己設(shè)計(jì)，成功率低，你可以到NCBI 的探針庫(kù)去找，或者查文獻(xiàn)找現(xiàn)成的

lipo2000的毒性眾所 ...

我用2000好像沒(méi)有感覺(jué)那么大的毒性，細(xì)胞是的不多。

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5樓2011-06-15 10:21:59

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pumpkin236(金幣+1): 2011-06-26 20:22:42

1、轉(zhuǎn)染后24H有點(diǎn)少了吧。我們實(shí)驗(yàn)室都是2-3天。
2、LIPO毒性大是肯定的。但是不同細(xì)胞不太一樣。你再看看你的細(xì)胞是否很易感。
3、RT和WT都要做，說(shuō)服力強(qiáng)。
4、最重要的，你設(shè)計(jì)的SIRNA要用相關(guān)軟件評(píng)估下，參考設(shè)計(jì)原則，不一定要完全互補(bǔ)配對(duì)

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6樓2011-06-16 18:25:44

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Originally posted by rb at 2011-06-15 10:21:08:
細(xì)胞死亡太多，可能和轉(zhuǎn)染試劑以及細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)，你應(yīng)該會(huì)做一個(gè)陰性的FAM標(biāo)記的轉(zhuǎn)染對(duì)照，看一下在這個(gè)過(guò)程中轉(zhuǎn)染效率以及siRNA是否穩(wěn)定，另最好做一個(gè)beta－actin siRNA的陽(yáng)性對(duì)照。如果是rt－PCR檢測(cè)的最好是2 ...

剛重新做了次，加了轉(zhuǎn)染試劑后24h后去看，發(fā)現(xiàn)有好多漂浮物，一團(tuán)一團(tuán)的，我感覺(jué)不像死細(xì)胞，團(tuán)聚物周圍貌似還毛茸茸的，貼壁細(xì)胞周圍也有一團(tuán)一團(tuán)的。是不是染菌了�。康歉杏X(jué)操作沒(méi)問(wèn)題，不知道是什么原因，頭疼死了。。。
謝謝了。。

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7樓2011-06-17 13:16:20

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pumpkin236(金幣+1): 2011-06-26 20:22:49

如果不是染菌，你可以換液試試。雖然我的實(shí)驗(yàn)2000毒性沒(méi)有那么大，但是脂質(zhì)體本身還是有有一定的毒性，會(huì)造成細(xì)胞的死亡的。你可以在轉(zhuǎn)染后4-6小時(shí)進(jìn)行換液，你再看看結(jié)果如何？

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Originally posted by rb at 2011-06-17 13:39:06:
如果不是染菌，你可以換液試試。雖然我的實(shí)驗(yàn)2000毒性沒(méi)有那么大，但是脂質(zhì)體本身還是有有一定的毒性，會(huì)造成細(xì)胞的死亡的。你可以在轉(zhuǎn)染后4-6小時(shí)進(jìn)行換液，你再看看結(jié)果如何？

我試過(guò)6h后換液，但是第二天去觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，還有好多漂浮的團(tuán)狀物。。是不是就是染菌。。。

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9樓2011-06-17 15:04:07

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Originally posted by zhuqiushi at 2011-06-15 07:22:11:
給樓主一個(gè)做RNA干擾的公司（武漢晶賽）的網(wǎng)址吧，上面有一些做RNA干擾的原理方法：http://www.genesil.com/knowledge.asp?kid=29
另外，我們以前做RNA干擾的時(shí)候都是至少設(shè)計(jì)兩條siRNA；再另外，你們 ...

我沒(méi)有摸條件，直接用的實(shí)驗(yàn)室常用的條件，一般24-36小時(shí)后提取RNA做RT-PCR。
但是第一次做的效果很不好，所以打算在做一次。

摸條件時(shí)，是不siRNA：lipo 是不變的？只是同時(shí)改變它們的濃度？

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10樓2011-06-23 16:36:27

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