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lilirong2009銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
細(xì)菌基因組DNA提取問題
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1.挑單菌落于3ml培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng) 2.取3ml菌液于EP管中8000rmp/min離心2min，收集菌體。 3、加100ulTE重懸菌體（儀器：漩渦振蕩器）8000 rpm/min離心 2min。 4、去上清，注意吸干多余的水分，沉淀物加入50ulTE緩沖液，反復(fù)吹打重懸菌體，加入50ul溶菌酶，混勻后37℃水浴30min 5加入460ulTE，加入30ul 10%SDS，混勻，加入蛋白酶K3ul，37℃溫浴30min以上直到溶液變澄清。澄清后，加入200ul 5mol/l的NaCl，充分混勻后，再加入預(yù)熱好的200ul CTAB/NaCl溶液，混勻后65℃溫浴30min 6.10000rpm/min離心5min取上清后后再加入等體積的氯仿異戊醇，混勻，12000rpm/min離心5min取上清，重復(fù)上次操作。直至界面不出現(xiàn)蛋白凝膠為止。 7.加入等體積Tris飽和酚/氯仿/異戊醇（25/24/1）。充分混勻后，12000r/min離心5min，吸取上清。重復(fù)上次操作。直至界面不出現(xiàn)蛋白凝膠為止。 8、小心取出上清用預(yù)冷兩倍體積的無水乙醇沉淀，在冰上放置1-2h或放冰箱凍存1-2h，沉淀后，再以12000rpm/min離心10min。 9、用500μL 70%的乙醇洗滌兩次，每次12000rmp/min離心2min，然后倒掉上清液（一定要倒扣離心管足夠長的時(shí)間，是乙醇盡可能流干凈，否則不易風(fēng)干）。 10、真空干燥后，用50μLTE或超純水溶解DNA，-20℃冰箱放置備用 我用這個(gè)方法提取的基因組DNA，以前怎么提取都沒問題，但是最近提取總是降解，混勻的時(shí)候已經(jīng)很輕了但是還是降解，還有其他導(dǎo)致降解的原因嗎？后來我用試劑盒提取也降解，這和氣溫高有關(guān)系嗎？操作的時(shí)候需要在冰上否？另外配好的Tris飽和酚/氯仿/異戊醇（25/24/1）溶液放在冰箱里是分層用的時(shí)候要混勻再用嗎？ |
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空谷幽風(fēng)
金蟲 (正式寫手)
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