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lizhijiang

木蟲 (著名寫手)

[交流] 電泳-分離膠凝得很慢�。�

各位蟲友和老師，小蟲是鮮嫩菜鳥，剛剛開始SDS-PAGE電泳。配制分離膠是10%的：三重水3.3ml，30%丙烯酰胺4ml，1.5mo/Ll Tris-HCl（pH 8.8） 2.5 ml，10%SDS 0.1ml，10% 過硫酸銨 0.1ml，TEMED 0.004 ml。制膠時幾個小時都不凝，這是什么原因？是不是可以這樣考慮：
1、30%丙烯酰胺中必須加甲叉雙丙烯酰胺？好多資料顯示需要加甲叉雙丙烯酰胺，但我參照的是Bio-Rad提供的配制方法啊？郁悶。
2、按照老師的指點(diǎn)說，加膠后，等小燒杯里的膠開始凝，玻璃板中的膠就應(yīng)該凝了�？墒菫槭裁磶讉€小時才開始凝？我試著增加了過硫酸銨和TEMED的用量，凝結(jié)的速度倒是很快，不知道這樣影響結(jié)果不？
3、即使膠凝結(jié)之后，我發(fā)現(xiàn)其硬度不夠大，會給后期帶來不便？怎么辦？
3、可不可以考慮換種分離膠的配方？希望蟲友提供建議。
希望論壇內(nèi)的筒子們多給建議，萬分感謝！

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1樓 2011-06-30 17:56:05

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lizhijiang

木蟲 (著名寫手)

我自己先占個位，靜待高人指點(diǎn)！

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2樓2011-06-30 17:56:28

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hooroberts

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amisking(金幣+2): 鼓勵應(yīng)助 2011-06-30 21:07:29
lizhijiang(金幣+1): 謝謝，我也是要準(zhǔn)備重新配一下試試的~ 2011-06-30 21:13:00

你沒加甲叉雙丙烯酰胺也能凝？
甲叉雙丙烯酰胺可是交聯(lián)劑，就是將丙烯酰胺連到一起的橋梁。
你參照的是Bio-Rad提供的配制方法，可是你看了它那30%丙烯酰胺得配法嗎，里面應(yīng)該有甲叉雙丙烯酰胺的吧

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4樓2011-06-30 19:10:49

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caisanrenju

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看天(金幣+3): 鼓勵回答 2011-06-30 23:10:02
lizhijiang(金幣+1): 多謝你！ 2011-07-01 08:13:25
silicare(EPI+1): 2011-07-02 14:46:27

1。如樓上所說，甲叉雙丙烯酰胺是必須加的，形成網(wǎng)絡(luò)的重要組成
2。TEMED多加肯定凝的快，無甚影響，最怕加太多還沒灌膠就凝了就不好了。
3。說實(shí)話，不知道你的沒加甲叉的膠是怎么凝的！你說的多軟沒概念……
3。膠的配方是全部一樣的，唯一的不同就是30%濃縮膠的用量不同，換配方的事情就不要想了

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5樓2011-06-30 22:45:09

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toxicpeach

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lizhijiang(金幣+2): 嚴(yán)重同意：以前我們實(shí)驗(yàn)室有人加入APS后不立即混勻就加入TEMED，之后也不混勻就加入膠板中，也會造成凝膠緩慢，或者凝膠不均勻的情況，樓主需要注意一下。 2011-07-01 08:14:01

引用回帖:

Originally posted by caisanrenju at 2011-06-30 22:45:09:
1。如樓上所說，甲叉雙丙烯酰胺是必須加的，形成網(wǎng)絡(luò)的重要組成
2。TEMED多加肯定凝的快，無甚影響，最怕加太多還沒灌膠就凝了就不好了。
3。說實(shí)話，不知道你的沒加甲叉的膠是怎么凝的！你說的多軟沒概念……
...

同意樓上的看法。
另外，還需要注意配膠的溫度，一般夏天可以按這個比例加TEMED，冬天溫度低就可以適當(dāng)多加點(diǎn)。
一般我們不多加過硫酸銨APS。
你可以不用自己配制30%的丙烯酰胺，我們都是用的買的，很多公司有賣，比如上海生工，500ml要100多元吧，還很好用。不接觸粉末丙烯酰胺，對我們來說可以減少受其毒害。
還需要說明的一點(diǎn)，以前我們實(shí)驗(yàn)室有人加入APS后不立即混勻就加入TEMED，之后也不混勻就加入膠板中，也會造成凝膠緩慢，或者凝膠不均勻的情況，樓主需要注意一下。

[ Last edited by toxicpeach on 2011-6-30 at 23:49 ]

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6樓2011-06-30 23:47:10

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zhaer

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lizhijiang(金幣+1): 應(yīng)該沒事。我做的是0.75mm。 2011-07-01 08:14:31

看看你的過硫酸銨是不是失效了，你要是跑1.0mm的膠，你加的量已經(jīng)足夠多了

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7樓2011-07-01 00:36:40

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lxfbsh2003

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8樓2011-07-01 09:05:47

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ma_zhe

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silicare(金幣+10): 處女帖，鼓勵交流 2011-07-02 14:46:41

嗯，我第一次做的時候膠也是不凝，后來我才發(fā)現(xiàn)是那個TEMED的問題，我換成新買的TEMED，做膠就很快凝了。�？纯词遣皇悄愕脑噭┦裁吹倪^期了，或者你的加入量是不是有問題（最好讓一個人看著你加，這樣不會加錯量）

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9樓2011-07-01 09:36:50

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lizhijiang

木蟲 (著名寫手)

凝了，凝了。好開心喲，謝謝大家。

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10樓2011-07-01 13:16:44

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xxzcf

鐵桿木蟲 (小有名氣)

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silicare(金幣+3, EPI+1): 謝謝參與 2011-07-02 14:47:27

引用回帖:

Originally posted by lizhijiang at 2011-06-30 10:56:05:
各位蟲友和老師，小蟲是鮮嫩菜鳥，剛剛開始SDS-PAGE電泳。配制分離膠是10%的：三重水3.3ml，30%丙烯酰胺4ml，1.5mo/Ll Tris-HCl（pH 8.8） 2.5 ml，10%SDS 0.1ml，10% 過硫酸銨 0.1ml，TEMED 0.004 ml。制膠時幾個 ...

交聯(lián)反應(yīng)需要時間，過快凝固不利于反應(yīng)的充分發(fā)生和均勻的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的形成。膠的治療不是最好。通常如果精度要求比較高，應(yīng)該將膠過夜，當(dāng)然要包裹在水濕的紙巾中，防止脫水。

APS應(yīng)新配，如果偷懶，可以配置后，分裝，冷凍在-20度，每次取出一份使用，即用即棄。

最早的配方，還要抽真空呢。不要著急。

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11樓2011-07-01 19:00:08

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btx362237729

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注意試劑別加漏了

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12樓2011-07-30 13:41:12

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zhouxj

至尊木蟲 (文壇精英)

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還有可能是過硫酸銨獲TEMED加少了，我上次就少加了一個零

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13樓2011-07-31 15:09:36

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tony0628

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1、30%丙烯酰胺中必須加甲叉雙丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺是形成交聯(lián)的橋梁。
2、你可以重新配置新鮮的過硫酸銨，且過硫酸銨的量可以不用增加，僅增加TEMED的用量即可，對電泳結(jié)果影響不大。
3、即使膠凝結(jié)之后，硬度不重要，本來就是柔軟，只要不脆就行，太脆的話不利于后期操作。
3、可以不用更改分離膠的配方，配方都是比例不一而已，膠不凝是試劑問題

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14樓2011-08-18 23:46:23

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啊哦小鑫123

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請問各位，百分之30的濃縮膠是什么意思，百分之30指的是什么

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15樓2013-05-02 21:53:08

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簡單回復(fù)

bhj5603樓

2011-06-30 18:07 回復(fù)

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