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lizhijiang

木蟲 (著名寫手)

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[交流] 電泳-分離膠凝得很慢�。�

各位蟲友和老師，小蟲是鮮嫩菜鳥，剛剛開始SDS-PAGE電泳。配制分離膠是10%的：三重水3.3ml，30%丙烯酰胺4ml，1.5mo/Ll Tris-HCl（pH 8.8） 2.5 ml，10%SDS 0.1ml，10% 過(guò)硫酸銨 0.1ml，TEMED 0.004 ml。制膠時(shí)幾個(gè)小時(shí)都不凝，這是什么原因？是不是可以這樣考慮：
1、30%丙烯酰胺中必須加甲叉雙丙烯酰胺？好多資料顯示需要加甲叉雙丙烯酰胺，但我參照的是Bio-Rad提供的配制方法�。坑魫�。
2、按照老師的指點(diǎn)說(shuō)，加膠后，等小燒杯里的膠開始凝，玻璃板中的膠就應(yīng)該凝了�？墒菫槭裁磶讉€(gè)小時(shí)才開始凝？我試著增加了過(guò)硫酸銨和TEMED的用量，凝結(jié)的速度倒是很快，不知道這樣影響結(jié)果不？
3、即使膠凝結(jié)之后，我發(fā)現(xiàn)其硬度不夠大，會(huì)給后期帶來(lái)不便？怎么辦？
3、可不可以考慮換種分離膠的配方？希望蟲友提供建議。
希望論壇內(nèi)的筒子們多給建議，萬(wàn)分感謝！

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1樓 2011-06-30 17:56:05

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hooroberts

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amisking(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-06-30 21:07:29
lizhijiang(金幣+1): 謝謝，我也是要準(zhǔn)備重新配一下試試的~ 2011-06-30 21:13:00

你沒(méi)加甲叉雙丙烯酰胺也能凝？
甲叉雙丙烯酰胺可是交聯(lián)劑，就是將丙烯酰胺連到一起的橋梁。
你參照的是Bio-Rad提供的配制方法，可是你看了它那30%丙烯酰胺得配法嗎，里面應(yīng)該有甲叉雙丙烯酰胺的吧

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4樓2011-06-30 19:10:49

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lizhijiang

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我自己先占個(gè)位，靜待高人指點(diǎn)！

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2樓2011-06-30 17:56:28

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caisanrenju

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看天(金幣+3): 鼓勵(lì)回答 2011-06-30 23:10:02
lizhijiang(金幣+1): 多謝你！ 2011-07-01 08:13:25
silicare(EPI+1): 2011-07-02 14:46:27

1。如樓上所說(shuō)，甲叉雙丙烯酰胺是必須加的，形成網(wǎng)絡(luò)的重要組成
2。TEMED多加肯定凝的快，無(wú)甚影響，最怕加太多還沒(méi)灌膠就凝了就不好了。
3。說(shuō)實(shí)話，不知道你的沒(méi)加甲叉的膠是怎么凝的！你說(shuō)的多軟沒(méi)概念……
3。膠的配方是全部一樣的，唯一的不同就是30%濃縮膠的用量不同，換配方的事情就不要想了

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5樓2011-06-30 22:45:09

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toxicpeach

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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
lizhijiang(金幣+2): 嚴(yán)重同意：以前我們實(shí)驗(yàn)室有人加入APS后不立即混勻就加入TEMED，之后也不混勻就加入膠板中，也會(huì)造成凝膠緩慢，或者凝膠不均勻的情況，樓主需要注意一下。 2011-07-01 08:14:01

引用回帖:

Originally posted by caisanrenju at 2011-06-30 22:45:09:
1。如樓上所說(shuō)，甲叉雙丙烯酰胺是必須加的，形成網(wǎng)絡(luò)的重要組成
2。TEMED多加肯定凝的快，無(wú)甚影響，最怕加太多還沒(méi)灌膠就凝了就不好了。
3。說(shuō)實(shí)話，不知道你的沒(méi)加甲叉的膠是怎么凝的！你說(shuō)的多軟沒(méi)概念……
...

同意樓上的看法。
另外，還需要注意配膠的溫度，一般夏天可以按這個(gè)比例加TEMED，冬天溫度低就可以適當(dāng)多加點(diǎn)。
一般我們不多加過(guò)硫酸銨APS。
你可以不用自己配制30%的丙烯酰胺，我們都是用的買的，很多公司有賣，比如上海生工，500ml要100多元吧，還很好用。不接觸粉末丙烯酰胺，對(duì)我們來(lái)說(shuō)可以減少受其毒害。
還需要說(shuō)明的一點(diǎn)，以前我們實(shí)驗(yàn)室有人加入APS后不立即混勻就加入TEMED，之后也不混勻就加入膠板中，也會(huì)造成凝膠緩慢，或者凝膠不均勻的情況，樓主需要注意一下。

[ Last edited by toxicpeach on 2011-6-30 at 23:49 ]

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6樓2011-06-30 23:47:10

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