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T.Shen
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【原創(chuàng)經(jīng)驗(yàn)篇】由一個簡單的酶切重組載體想到的.......... 已有20人參與
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不得不承認(rèn)，有時候做實(shí)驗(yàn)確實(shí)運(yùn)氣有很大關(guān)系；前段時間，做啥出啥，那叫一個順利呀。。。 可是最近，有些低迷，就拿很簡單的一個雙酶切，耽擱了偶2天時間，如果讓小老板知道了，那完了，狂風(fēng)暴雨一般呀。。。本人原帖：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=3350346&fpage=1 首先感謝回復(fù)的各位童鞋們，你們的建議很有用，我謝謝了，隨后BB一一奉上，請注意查收！  目前本人雙酶切已經(jīng)徹底搞定，目的基因已經(jīng)成功連接至載體上了，其實(shí)即便沒有雙酶切的圖我也可以證明，見后面！ 雖說一個簡單的雙酶切，沒什么大不了的，確實(shí)沒有什么大不了的，可是小問題往往能夠反映出大智慧。。。相信一個謹(jǐn)慎的科研者在細(xì)節(jié)上肯定做的很好，正如最近一部比較火爆的電視劇《裸婚時代》：細(xì)節(jié)打敗愛情，同樣我這里想說的是：細(xì)節(jié)打敗實(shí)驗(yàn)，如果你留心一下，看看你們實(shí)驗(yàn)室大家平時的做實(shí)驗(yàn)的習(xí)慣，你便可以看出來這個人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及種種。。。我們實(shí)驗(yàn)室便是如此！ 貌似扯得有些遠(yuǎn)了，其實(shí)想說的就是細(xì)節(jié)這個東西，尤其在科研上，很重要，非常重要！不要因?yàn)樗”阌X得無所謂，便覺得小case，其實(shí)不然，小細(xì)節(jié)做好了，那么大事絕對成矣，只不過是遲早的事！ 其實(shí)酶切這個東西吧，看似簡單，其實(shí)講究很多。。。當(dāng)然各種方法體系網(wǎng)上到處都是，包括公司的說明書上，這里我講的是我的一些想法，還請各位指正！ 就拿我這酶切驗(yàn)證重組載體吧，首先大體說說基本步驟： 1：雙酶切載體，然后電泳看是否切開，如果沒有切開，有可能是酶太少，也有可能是作用時間不夠，切忌這個時候不能直接純化然后去做連接，當(dāng)然了可以做連接，但是成功率太低，浪費(fèi)了東西不說，寶貴的時間也會浪費(fèi)，所以一定要保證載體酶切的很干凈，一點(diǎn)拖尾都不能有，然后純化一下，當(dāng)然了純化是個濃縮的過程，比如我切50ul的體系，最后純化的時候，終體積20-30ul即可，然后點(diǎn)樣看看怎么樣？這一塊有一個小細(xì)節(jié)，就是點(diǎn)完樣之后，可以把其它的純化產(chǎn)物繼續(xù)加到柱子上（現(xiàn)在大家基本都用試劑盒進(jìn)行純化吧，所以離心柱你懂的）！讓它繼續(xù)..... 2：酶切基因，其實(shí)這一步很簡單，沒有什么特殊要求，過夜酶切或者切它8 9 10個小時都行，隨后進(jìn)行純化，純化終體積見上面；最后點(diǎn)樣看亮度。。。 3：連接：連接之前呢，先將載體和基因混合，熱活化一下，即45度10min，然后加連接酶，buffer，ddH2O；體系不用我說了，大家應(yīng)該很清楚了，我的原則呢，基因比載體多些。。。 4：轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化前45度活化10min，然后轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌感受態(tài)。。。涂布于加抗生素的板子上，這一步因載體不同，抗性標(biāo)記也不同，篩選標(biāo)記也不同，常見的就是藍(lán)白斑篩選了，涂布X-gal少不了，過夜培養(yǎng)，一般18-24h,之后長出來的很少有對的。。。挑幾個疑似連接上的單克隆劃線第二天驗(yàn)證。。。 5：驗(yàn)證：<1>PCR，可以作為初步篩選，用幾個菌的裂解液當(dāng)模板進(jìn)行PCR，原來壇子上有人建議用快檢的方法，也可以；PCR出來點(diǎn)樣，有條帶的那基本就對了； <2>能P出來的菌，提質(zhì)粒，然后雙酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證對了基本你的克隆也就搞定了，下一步呢？可以測你想要的很多數(shù)據(jù)了。。。。因各種實(shí)驗(yàn)不同，以下就不贅述了。。。。 目前本人已經(jīng)成功進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證了，至于什么問題呢，大家如果感興趣，見上面鏈接，直接上圖 泳道1：marker 泳道2：載體digest 泳道3：gene digest 泳道4,5：重組載體 digest 我連接的這個片段500bp,雖說不大，可是做一個漂亮的雙酶切，得到底下那條基因的條帶還是比較難的，不過今天我重新提了質(zhì)粒，質(zhì)粒比較亮，然后多切了一些，這才勉強(qiáng)得到這張圖，大家輕拍。。。呵呵！ 所以大家如果以后連接小片段的話，尤其是小片段練到大載體上的話，提取的重組質(zhì)粒一定要亮，質(zhì)量一定要大，不然做雙酶切驗(yàn)證那是何其的困難啊。。。我原先提取的重組載體不是很亮，然后雙酶切，只有上面載體的條帶，底下基因的那條木有啊，就是木有，你說郁悶不郁悶？所以切記：質(zhì)粒一定要亮！ 當(dāng)然了，酶切驗(yàn)證的體系呢，一般10ul就可以了，但是如果片段小的話，就像我這種情況，也可以切20ul體系的。。。 說了這么多，其實(shí)是本人的一些心得吧，拿來與大家分享，希望大家實(shí)驗(yàn)都順利進(jìn)行，每天像打雞血一樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果刷刷刷的往出蹦。。。呵呵呵！ [ Last edited by 天使托 on 2011-7-1 at 22:33 ] |
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西瓜(EPI+1): 差點(diǎn)漏了 2011-07-05 19:58:58
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“3：連接：連接之前呢，先將載體和基因混合，熱活化一下，即45度10min，然后加連接酶，buffer，ddH2O；體系不用我說了，大家應(yīng)該很清楚了，我的原則呢，基因比載體多些。。�！� “基因比載體多些”是個很籠統(tǒng)的表述，因?yàn)椤痘蚩寺 飞弦幌蚴墙ㄗh外源片段比載體多的。這個多主要表現(xiàn)在量上，摩爾數(shù)，而不是分子量。例如載體3KB而外源片段1KB，那么當(dāng)摩爾數(shù)相同時，跑膠后兩條帶的亮度是不同的，載體帶比外源帶亮約三倍，但它們的摩爾數(shù)是相同的，所以能下定論說它們的量是相同的。為了增加連接時候載體和外源片段相互碰撞連接成功的幾率，外源片段和載體的摩爾數(shù)比例應(yīng)該大于1，我喜歡用3。 “4：轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化前45度活化10min，然后轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌感受態(tài)。。。涂布于加抗生素的板子上，這一步因載體不同，抗性標(biāo)記也不同，篩選標(biāo)記也不同，常見的就是藍(lán)白斑篩選了，涂布X-gal少不了，過夜培養(yǎng)，一般18-24h,之后長出來的很少有對的。。。挑幾個疑似連接上的單克隆劃線第二天驗(yàn)證。。。” 藍(lán)白斑篩選的時候選用的抗生素是氨芐青霉素，抗性基因?yàn)橐粋�可以將抗生素內(nèi)環(huán)切開導(dǎo)致抗生素失效的酶，所以培養(yǎng)時間長之后，陽性克隆的周圍抗生素濃度下降，原本被抗生素抑制的大腸桿菌就能長出來，構(gòu)成假陽性。因?yàn)檫@種菌是后來才長出來的，所以會比陽性克隆長得小，又因?yàn)橹饕窃陉栃钥寺∨赃呴L出來的，所以叫做衛(wèi)星菌落。 |
18樓2011-07-05 19:30:26
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