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friya0910新蟲 (正式寫手)
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[交流]
質(zhì)粒是否需要酶切后再電泳？ 已有5人參與
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| 將連接有目的片段的質(zhì)粒做雙酶切，跑電泳的時候想加一個空質(zhì)粒，那這個空質(zhì)粒是不是應(yīng)該先單酶切一下��？不然跑出來的不是線性的話就和前面雙酶切的就沒有可比性了啊？ |
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
dhd997(金幣+5, EPI+1): 辛苦，一并獎勵了 2011-07-05 19:16:27
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
dhd997(金幣+5, EPI+1): 辛苦，一并獎勵了 2011-07-05 19:16:27
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我現(xiàn)在只是把目的片段連接到了pMD19-T載體上，還沒做到雙酶切重組質(zhì)粒這一步，我現(xiàn)在就想把目的片段從pMD19-T載體上切下來，切完之后跑膠需不需要加一個空載體做對照啊？ 原來是TA克隆，目的是看有沒有連接上外源片段。你沒有必要雙酶切那么費事的，單酶切就可以了。你這樣做是需要加一個對照的，對照應(yīng)該為空載體，選用的酶切位點最好是外源片段上沒有的位點，同時在載體上只有一個位點，這樣切出來無論是有沒有帶有外源片段，都是一條帶，但是帶有外源片段的質(zhì)粒條帶會大于不帶外源片段的質(zhì)粒。 如果是只在外源片段上有但是載體上沒有的位點，那么如果酶失效了，或者其它原因?qū)е旅盖胁怀晒Γ敲促|(zhì)粒就不被切開，判斷起來就稍微麻煩了些。 還有一個問題是我才發(fā)現(xiàn)pMD19-T載體在TA克隆位點后居然有我的下游引物的酶切位點BamHI 這樣會不會影響酶切��？最后雙酶切以后會是3條帶嗎？ 不一定是三條帶，如果兩個位點之間相隔很近，那么切出來的條帶會很短，跑膠的時候會跑出去根本看不見，畢竟在多克隆位點處的酶切位點是很密集的。你選用的鑒別方法可以再仔細(xì)考慮一下，包括單酶切還是雙酶切，選用什么酶。 |
9樓2011-07-05 18:48:56
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