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friya0910新蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[交流]
質(zhì)粒是否需要酶切后再電泳？ 已有5人參與
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| 將連接有目的片段的質(zhì)粒做雙酶切，跑電泳的時(shí)候想加一個(gè)空質(zhì)粒，那這個(gè)空質(zhì)粒是不是應(yīng)該先單酶切一下�。坎蝗慌艹鰜�(lái)的不是線性的話就和前面雙酶切的就沒(méi)有可比性了��？ |
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dhd997(金幣+5, EPI+1): 辛苦，一并獎(jiǎng)勵(lì)了 2011-07-05 19:16:27
小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
dhd997(金幣+5, EPI+1): 辛苦，一并獎(jiǎng)勵(lì)了 2011-07-05 19:16:27
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我現(xiàn)在只是把目的片段連接到了pMD19-T載體上，還沒(méi)做到雙酶切重組質(zhì)粒這一步，我現(xiàn)在就想把目的片段從pMD19-T載體上切下來(lái)，切完之后跑膠需不需要加一個(gè)空載體做對(duì)照��？ 原來(lái)是TA克隆，目的是看有沒(méi)有連接上外源片段。你沒(méi)有必要雙酶切那么費(fèi)事的，單酶切就可以了。你這樣做是需要加一個(gè)對(duì)照的，對(duì)照應(yīng)該為空載體，選用的酶切位點(diǎn)最好是外源片段上沒(méi)有的位點(diǎn)，同時(shí)在載體上只有一個(gè)位點(diǎn)，這樣切出來(lái)無(wú)論是有沒(méi)有帶有外源片段，都是一條帶，但是帶有外源片段的質(zhì)粒條帶會(huì)大于不帶外源片段的質(zhì)粒。 如果是只在外源片段上有但是載體上沒(méi)有的位點(diǎn)，那么如果酶失效了，或者其它原因?qū)е旅盖胁怀晒�，那么質(zhì)粒就不被切開(kāi)，判斷起來(lái)就稍微麻煩了些。 還有一個(gè)問(wèn)題是我才發(fā)現(xiàn)pMD19-T載體在TA克隆位點(diǎn)后居然有我的下游引物的酶切位點(diǎn)BamHI 這樣會(huì)不會(huì)影響酶切啊？最后雙酶切以后會(huì)是3條帶嗎？ 不一定是三條帶，如果兩個(gè)位點(diǎn)之間相隔很近，那么切出來(lái)的條帶會(huì)很短，跑膠的時(shí)候會(huì)跑出去根本看不見(jiàn)，畢竟在多克隆位點(diǎn)處的酶切位點(diǎn)是很密集的。你選用的鑒別方法可以再仔細(xì)考慮一下，包括單酶切還是雙酶切，選用什么酶。 |
9樓2011-07-05 18:48:56
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4樓2011-07-04 23:05:53
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