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[交流]
【求助/交流】質(zhì)粒DNA可以不通過酶切直接跑電泳檢測嗎？
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我最近做克隆，提取質(zhì)粒DNA后，直接用以前擴增目的條帶的引物來擴增質(zhì)粒DNA，想看看是否是陽性的克隆，可是怎么也擴增不出來，所以第一個問題是請教各位：是否可以用這樣的引物來擴增？我個人感覺理論上是可以的！ 其次是，我的質(zhì)粒DNA是不是有問題，也會導致這樣的情況，那么就想請教質(zhì)粒DNA是否不需要經(jīng)過酶切而直接跑電泳檢測呢？ 以及如何來檢測陽性克隆是做好的方法？謝謝大家 我篩選單菌落是用的IPTG和X-GOL，也就是挑選白色的單菌落后培養(yǎng)提取質(zhì)粒DNA！ |
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2樓2011-04-06 10:24:21
3樓2011-04-06 10:43:17
1949stone(EPI+1): 學習下 2011-04-06 14:07:00
wangy0908(金幣+20): 2011-04-06 20:59:17
wangy0908(金幣+20): 2011-04-06 20:59:17
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用你的引物來鑒定是沒有問題的，確實單酶切之后效果會好，但得保證你的酶切位點不在PCR引物中。 個人認為你提取的質(zhì)粒跑電泳是沒有意義的。因為藍白斑篩選也會有假陽性產(chǎn)生，特別是用pMD-18T載體，比20T的效果好差一些，當然價格上也便宜一些。lz的情況應該是假陽性克隆，最好不要單獨根據(jù)顏色來篩選，可以采用菌落PCR先初步鑒定，然后搖菌提質(zhì)粒，得到質(zhì)粒后可以PCR，最好也單酶切后電泳來鑒定。不酶切直接跑電泳可能出現(xiàn)的情況比較復雜，不好判斷。 |
4樓2011-04-06 12:20:36
5樓2011-04-06 16:20:33
6樓2011-04-06 16:42:22
7樓2011-04-06 16:44:14
9樓2011-04-07 07:18:00
10樓2011-04-07 07:23:20
12樓2011-04-07 09:12:12
13樓2011-04-07 10:41:20
★ ★ ★ ★ ★ ★
wangy0908(金幣+20): Thanks for your reply, I will try it! 2011-04-07 20:44:01
dhd997(金幣+6, EPI+1): 歡迎繼續(xù)交流 2011-04-08 08:50:05
wangy0908(金幣+20): Thanks for your reply, I will try it! 2011-04-07 20:44:01
dhd997(金幣+6, EPI+1): 歡迎繼續(xù)交流 2011-04-08 08:50:05
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1.其實最快速的方法是進行菌落PCR，可以省去提質(zhì)粒這一步，節(jié)省時間，當然以質(zhì)粒為模板來進行PCR驗證也是完全沒有任何問題的。 2.直接通過跑質(zhì)粒來檢測是否是陽性克隆是不保險的，因為質(zhì)粒一般會跑出三條帶，分別為超螺旋、開環(huán)和線性三種狀態(tài)，如果你的插入片段不是特別大的話是無法區(qū)分的，還有一般從不同感受態(tài)細胞里提出的同一種質(zhì)粒帶型也是不同的，即使是同一種感受態(tài)細胞提出的同一種質(zhì)粒有時帶型也會有些許差異。 3.通過酶切驗證是一種比較直觀且相對可信的方法，因為有時候因為序列本身比較特殊（如高GC或二級結(jié)構比較多）或引物設計不夠合理，通過普通PCR方法很難擴出來，用酶切驗證就比較方便了。但前提是你要選好合適的酶切位點！單酶切或雙酶切均可，不過你要知道切完后會出現(xiàn)幾條帶，每條帶應該多大。 |
14樓2011-04-07 12:48:23
15樓2011-04-08 05:08:35
17樓2011-04-08 10:52:02
18樓2011-04-08 11:57:19
19樓2011-04-08 16:00:55
20樓2011-04-10 22:28:18
21樓2011-04-11 12:19:39
22樓2011-04-11 12:25:04
23樓2011-04-11 20:43:03
24樓2012-04-24 20:32:08
25樓2014-05-06 15:17:06
簡單回復
zyxme8樓
2011-04-06 17:11
回復
寧夏808311樓
2011-04-07 07:48
回復
祝福
zyxme16樓
2011-04-08 07:00
回復
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