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wangy0908

金蟲(chóng) (正式寫手)

[交流] 【求助/交流】質(zhì)粒DNA可以不通過(guò)酶切直接跑電泳檢測(cè)嗎？

我最近做克隆，提取質(zhì)粒DNA后，直接用以前擴(kuò)增目的條帶的引物來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒DNA，想看看是否是陽(yáng)性的克隆，可是怎么也擴(kuò)增不出來(lái)，所以第一個(gè)問(wèn)題是請(qǐng)教各位：是否可以用這樣的引物來(lái)擴(kuò)增？我個(gè)人感覺(jué)理論上是可以的！
其次是，我的質(zhì)粒DNA是不是有問(wèn)題，也會(huì)導(dǎo)致這樣的情況，那么就想請(qǐng)教質(zhì)粒DNA是否不需要經(jīng)過(guò)酶切而直接跑電泳檢測(cè)呢？
以及如何來(lái)檢測(cè)陽(yáng)性克隆是做好的方法？謝謝大家

我篩選單菌落是用的IPTG和X-GOL，也就是挑選白色的單菌落后培養(yǎng)提取質(zhì)粒DNA！
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whilecy

銀蟲(chóng) (初入文壇)
雖然不懂，但覺(jué)得你的研究很有前途，路過(guò)~
2樓2011-04-06 10:24:21
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lxj341401

至尊木蟲(chóng) (著名寫手)
★ ★ ★ ★
1949stone(金幣+4): 鼓勵(lì) 2011-04-06 14:06:25
wangy0908(金幣+10): 2011-04-06 20:58:11
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2011-04-06 10:12:33:
我最近做克隆，提取質(zhì)粒DNA后，直接用以前擴(kuò)增目的條帶的引物來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒DNA，想看看是否是陽(yáng)性的克隆，可是怎么也擴(kuò)增不出來(lái)，所以第一個(gè)問(wèn)題是請(qǐng)教各位：是否可以用這樣的引物來(lái)擴(kuò)增？我個(gè)人感覺(jué)理論上是可以的！ ...

直接用是可以的，只要引物3‘和模板匹配較好就可以了，建議PCR時(shí)質(zhì)粒模板先單酶切處理，這樣PCR容易。質(zhì)粒電泳如果看大小的話最好單酶切處理，不酶切的話電泳表現(xiàn)分子大小與實(shí)際大小有差別的。
3樓2011-04-06 10:43:17
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zhaohq1209

鐵桿木蟲(chóng) (著名寫手)
1949stone(EPI+1): 學(xué)習(xí)下 2011-04-06 14:07:00
wangy0908(金幣+20): 2011-04-06 20:59:17
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2011-04-06 10:12:33:
我最近做克隆，提取質(zhì)粒DNA后，直接用以前擴(kuò)增目的條帶的引物來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒DNA，想看看是否是陽(yáng)性的克隆，可是怎么也擴(kuò)增不出來(lái)，所以第一個(gè)問(wèn)題是請(qǐng)教各位：是否可以用這樣的引物來(lái)擴(kuò)增？我個(gè)人感覺(jué)理論上是可以的！ ...

用你的引物來(lái)鑒定是沒(méi)有問(wèn)題的，確實(shí)單酶切之后效果會(huì)好，但得保證你的酶切位點(diǎn)不在PCR引物中。

個(gè)人認(rèn)為你提取的質(zhì)粒跑電泳是沒(méi)有意義的。因?yàn)樗{(lán)白斑篩選也會(huì)有假陽(yáng)性產(chǎn)生，特別是用pMD-18T載體，比20T的效果好差一些，當(dāng)然價(jià)格上也便宜一些。lz的情況應(yīng)該是假陽(yáng)性克隆，最好不要單獨(dú)根據(jù)顏色來(lái)篩選，可以采用菌落PCR先初步鑒定，然后搖菌提質(zhì)粒，得到質(zhì)粒后可以PCR，最好也單酶切后電泳來(lái)鑒定。不酶切直接跑電泳可能出現(xiàn)的情況比較復(fù)雜，不好判斷。
4樓2011-04-06 12:20:36
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zgle

金蟲(chóng) (正式寫手)
可以可以可以
5樓2011-04-06 16:20:33
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wht_nmg

木蟲(chóng) (著名寫手)
認(rèn)真看看
6樓2011-04-06 16:42:22
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wht_nmg

木蟲(chóng) (著名寫手)
認(rèn)真看看
7樓2011-04-06 16:44:14
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wangy0908

金蟲(chóng) (正式寫手)
引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2011-04-06 12:20:36:
用你的引物來(lái)鑒定是沒(méi)有問(wèn)題的，確實(shí)單酶切之后效果會(huì)好，但得保證你的酶切位點(diǎn)不在PCR引物中。

個(gè)人認(rèn)為你提取的質(zhì)粒跑電泳是沒(méi)有意義的。因?yàn)樗{(lán)白斑篩選也會(huì)有假陽(yáng)性產(chǎn)生，特別是用pMD-18T載體，比20T的效 ...

我沒(méi)有進(jìn)行酶切，就直接跑的PCR，怎么也擴(kuò)增不出來(lái)。我用的是pGEM-T載體。
謝謝。還想問(wèn)問(wèn)，如果不酶切跑PCR，能跑出來(lái)的嗎？因?yàn)槿绻芘艹鰜?lái)的話，我就覺(jué)得我的質(zhì)粒DNA是肯定有問(wèn)題了，就得重新再做鏈接以及轉(zhuǎn)化這些的。
9樓2011-04-07 07:18:00
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wangy0908

金蟲(chóng) (正式寫手)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-04-06 10:43:17:
直接用是可以的，只要引物3‘和模板匹配較好就可以了，建議PCR時(shí)質(zhì)粒模板先單酶切處理，這樣PCR容易。質(zhì)粒電泳如果看大小的話最好單酶切處理，不酶切的話電泳表現(xiàn)分子大小與實(shí)際大小有差別的。

謝謝。我跑的PCR的時(shí)候沒(méi)有進(jìn)行單酶切。如果不進(jìn)行單酶切，能跑出來(lái)嗎？
10樓2011-04-07 07:23:20
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zhaohq1209

鐵桿木蟲(chóng) (著名寫手)
★ ★ ★
wangy0908(金幣+5): 謝謝，學(xué)習(xí)不少。呵呵 2011-04-07 10:40:01
dhd997(金幣+3): 專業(yè) 2011-04-08 08:49:43
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2011-04-07 07:18:00:
我沒(méi)有進(jìn)行酶切，就直接跑的PCR，怎么也擴(kuò)增不出來(lái)。我用的是pGEM-T載體。
謝謝。還想問(wèn)問(wèn)，如果不酶切跑PCR，能跑出來(lái)的嗎？因?yàn)槿绻芘艹鰜?lái)的話，我就覺(jué)得我的質(zhì)粒DNA是肯定有問(wèn)題了，就得重新再做鏈接以及 ...

不酶切是可以直接作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)的。PCR過(guò)程需要加入陽(yáng)性和陰性對(duì)照，如果你確定沒(méi)有其他方面的問(wèn)題，真的可能就是你的質(zhì)粒有問(wèn)題。

可以再做連接轉(zhuǎn)化，重新篩選。

祝好運(yùn)！
12樓2011-04-07 09:12:12
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wangy0908

金蟲(chóng) (正式寫手)
希望能好運(yùn)的啊，快做出來(lái)的，都做了很久了！
13樓2011-04-07 10:41:20
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★ ★ ★ ★ ★ ★
wangy0908(金幣+20): Thanks for your reply, I will try it! 2011-04-07 20:44:01
dhd997(金幣+6, EPI+1): 歡迎繼續(xù)交流 2011-04-08 08:50:05
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2011-04-06 10:12:33:
我最近做克隆，提取質(zhì)粒DNA后，直接用以前擴(kuò)增目的條帶的引物來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒DNA，想看看是否是陽(yáng)性的克隆，可是怎么也擴(kuò)增不出來(lái)，所以第一個(gè)問(wèn)題是請(qǐng)教各位：是否可以用這樣的引物來(lái)擴(kuò)增？我個(gè)人感覺(jué)理論上是可以的！ ...

1.其實(shí)最快速的方法是進(jìn)行菌落PCR，可以省去提質(zhì)粒這一步，節(jié)省時(shí)間，當(dāng)然以質(zhì)粒為模板來(lái)進(jìn)行PCR驗(yàn)證也是完全沒(méi)有任何問(wèn)題的。
2.直接通過(guò)跑質(zhì)粒來(lái)檢測(cè)是否是陽(yáng)性克隆是不保險(xiǎn)的，因?yàn)橘|(zhì)粒一般會(huì)跑出三條帶，分別為超螺旋、開(kāi)環(huán)和線性三種狀態(tài)，如果你的插入片段不是特別大的話是無(wú)法區(qū)分的，還有一般從不同感受態(tài)細(xì)胞里提出的同一種質(zhì)粒帶型也是不同的，即使是同一種感受態(tài)細(xì)胞提出的同一種質(zhì)粒有時(shí)帶型也會(huì)有些許差異。
3.通過(guò)酶切驗(yàn)證是一種比較直觀且相對(duì)可信的方法，因?yàn)橛袝r(shí)候因?yàn)樾蛄斜旧肀容^特殊（如高GC或二級(jí)結(jié)構(gòu)比較多）或引物設(shè)計(jì)不夠合理，通過(guò)普通PCR方法很難擴(kuò)出來(lái)，用酶切驗(yàn)證就比較方便了。但前提是你要選好合適的酶切位點(diǎn)！單酶切或雙酶切均可，不過(guò)你要知道切完后會(huì)出現(xiàn)幾條帶，每條帶應(yīng)該多大。
14樓2011-04-07 12:48:23
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wangy0908

金蟲(chóng) (正式寫手)
今天我重新做了一次PCR，以前次PCR產(chǎn)物膠回收后作為模板，兩次PCR的引物是一樣的，但是今天得到的條帶的大小明顯比以前小了1kb左右，很是費(fèi)解！這是什么原因造成的��？因?yàn)槲掖蛩阒匦伦鲦溄雍娃D(zhuǎn)化，所以就索性想這樣來(lái)檢查一下DNA，以找到什么地方有問(wèn)題的！結(jié)果卻出現(xiàn)了這樣的現(xiàn)象！
為什么會(huì)出現(xiàn)這樣的情況呢？
15樓2011-04-08 05:08:35
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引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2011-04-08 05:08:35:
今天我重新做了一次PCR，以前次PCR產(chǎn)物膠回收后作為模板，兩次PCR的引物是一樣的，但是今天得到的條帶的大小明顯比以前小了1kb左右，很是費(fèi)解！這是什么原因造成的��？因?yàn)槲掖蛩阒匦伦鲦溄雍娃D(zhuǎn)化，所以就索性想這 ...

先確認(rèn)一下你的引物與模板的錯(cuò)配嚴(yán)不嚴(yán)重
17樓2011-04-08 10:52:02
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p120933799

金蟲(chóng) (小有名氣)
18樓2011-04-08 11:57:19
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sfb1020

金蟲(chóng) (小有名氣)
沒(méi)有單酶切也可以P出來(lái)，我一直就這么做。直接用提的質(zhì)粒進(jìn)行PCR，如果能P出來(lái)，再進(jìn)行酶切。
19樓2011-04-08 16:00:55
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wangy0908

金蟲(chóng) (正式寫手)
還有其他正解沒(méi)有？謝謝大家
20樓2011-04-10 22:28:18
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匿名

用戶注銷 (初入文壇)
本帖僅樓主可見(jiàn)
21樓2011-04-11 12:19:39
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Originally posted by 愛(ài)加Audrey at 2011-04-11 12:19:39:
我試過(guò)菌液PCR但是沒(méi)P出來(lái)，質(zhì)粒PCR是沒(méi)問(wèn)題的，而且跑的很好。想問(wèn)一下，菌液PCR要注意哪些？

菌液pcr跟質(zhì)粒pcr基本一樣，一般把一個(gè)菌落挑到400ml培養(yǎng)基里搖2h就可以拿來(lái)做pcr了，取2-3ul當(dāng)模板就夠了，PCR程序跟質(zhì)粒pcr一樣
22樓2011-04-11 12:25:04
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wangy0908

金蟲(chóng) (正式寫手)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽風(fēng) at 2011-04-11 12:25:04:
菌液pcr跟質(zhì)粒pcr基本一樣，一般把一個(gè)菌落挑到400ml培養(yǎng)基里搖2h就可以拿來(lái)做pcr了，取2-3ul當(dāng)模板就夠了，PCR程序跟質(zhì)粒pcr一樣

PCR程序跟質(zhì)粒pcr一樣,could you please give a pcr protocol  for plasmid?

thanks very much
23樓2011-04-11 20:43:03
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zxy664063437

新蟲(chóng) (初入文壇)
★
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
不酶切，可以跑出來(lái)的，我跑過(guò)，但是條帶大小和目的片段的大小不一樣
24樓2012-04-24 20:32:08
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beatrice1018

新蟲(chóng) (初入文壇)
★
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
引用回帖:
4樓: Originally posted by zhaohq1209 at 2011-04-06 12:20:36
用你的引物來(lái)鑒定是沒(méi)有問(wèn)題的，確實(shí)單酶切之后效果會(huì)好，但得保證你的酶切位點(diǎn)不在PCR引物中。

個(gè)人認(rèn)為你提取的質(zhì)粒跑電泳是沒(méi)有意義的。因?yàn)樗{(lán)白斑篩選也會(huì)有假陽(yáng)性產(chǎn)生，特別是用pMD-18T載體，比20T的效果好 ...

親，我們做實(shí)驗(yàn)時(shí)遇到了菌落PCR有目的條帶，但是搖菌提質(zhì)粒時(shí)沒(méi)有目的條帶，而是在1000bp以下有不成條帶的白色亮區(qū)的現(xiàn)象（我不大會(huì)描述······），求解答！
25樓2014-05-06 15:17:06
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zyxme8樓
2011-04-06 17:11   回復(fù)  
寧夏808311樓
2011-04-07 07:48   回復(fù)  
祝福
zyxme16樓
2011-04-08 07:00   回復(fù)  
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