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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 求助DNA提取方法
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追夢的人1987金蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助DNA提取方法
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| 本人最近用微波法提細菌DNA，提了幾天都毫無結果，想問一下大蝦們有什么好的方法，我提DNA主要是用于16rDNA擴增，然后進行測序鑒定菌種的 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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dhd997(金幣+5, EPI+1): good 2011-07-05 19:17:12
1949stone:編輯內(nèi)容 2011-07-05 19:42
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追夢的人1987(金幣+1): 2011-07-05 22:20:20
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追夢的人1987(金幣+1): 2011-07-05 22:20:20
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2.10.1.1染色體總DNA少量提取 （1） 取過夜培養(yǎng)菌液1.5ml于2.0ml EP管中，9000rpm離心2min，棄上清，收集菌體，吸干水分； （2） 對G+菌株加100g/ml溶菌酶50l，30℃處理1h； （3） 裂解：向每管加200l裂解緩沖液（40mmol/L Tris-HCl，20mmol/L 乙酸鈉，1mol/L EDTA，1% SDS，pH8.0），迅速劇烈抽吸懸浮菌體，使其裂解； （4） 加入66l 5mol/L NaCl，充分混勻，12000rpm離心10min，沉淀蛋白及細胞壁； （5） 收集上清液，用等體積苯酚/氯仿抽提，12000rpm離心10min （6） 收集上清液，加入與上清液等體積的氯仿:異戊醇（24:1），混勻，12000 rpm離心10 min； （7） 取上清液加入2倍體積無水乙醇，溫和顛倒，13000 rpm離心15 min； （8） 棄上清，沉淀物用1ml 75%的乙醇沖洗2-3次，真空干燥器干燥總DNA沉淀； （9） 基因組DNA沉淀用30 μl TE 或ddH2O溶解。并進行瓊脂糖核酸電泳，檢驗大小及濃度，-20℃儲存。 [ Last edited by 1949stone on 2011-7-5 at 19:43 ] |
2樓2011-07-05 19:03:10
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dhd997(金幣+5, EPI+1): 2011-07-06 07:42:38
dhd997(金幣+5, EPI+1): 2011-07-06 07:42:38
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發(fā)上來的時候有的出現(xiàn)了亂碼，重發(fā)一次，有些單位用漢字打 2.10.1.1染色體總DNA少量提取 （1） 取過夜培養(yǎng)菌液1.5毫升于2.0毫升EP管中，9000rpm離心2min，棄上清，收集菌體，吸干水分； （2） 對G+菌株加100微克/毫升溶菌酶50微升，30℃處理1h； （3） 裂解：向每管加200微升裂解緩沖液（40毫摩爾/升 Tris-HCl，毫摩爾/升乙酸鈉，1摩爾/升 EDTA，1% SDS，pH8.0），迅速劇烈抽吸懸浮菌體，使其裂解； （4） 加入66微升5摩爾/升NaCl，充分混勻，12000rpm離心10min，沉淀蛋白及細胞壁； （5） 收集上清液，用等體積苯酚抽提，12000rpm離心10min；（也可嘗試用苯酚/氯仿） （6） 收集上清液，加入與上清液等體積的氯仿:異戊醇（24:1），混勻，12000 rpm離心10 min； （7） 取上清液加入2倍體積無水乙醇，溫和顛倒，13000 rpm離心15 min； （8） 棄上清，沉淀物用1毫升75%的乙醇沖洗2-3次，真空干燥器干燥總DNA沉淀； （9） 基因組DNA沉淀用30微升TE 或ddH2O溶解。并進行瓊脂糖核酸電泳，檢驗大小及濃度，-20℃儲存。 要是你不知道是不是G+，那還是加吧。 |
7樓2011-07-06 00:22:00
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