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zhangyonghu木蟲 (小有名氣)
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[求助]
有做AFLP的么？
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最近老師讓做AFLP。我一點(diǎn)也不了解，好做么？我看還得酶切什么的，好像很麻煩的！這個(gè)實(shí)驗(yàn)的成功率怎么樣?以后號(hào)處理么？ 好心人幫幫我吧，有相關(guān)的東西給我發(fā)一下，我的郵箱是：zhangyonghu0815@126.com 謝謝了，就算是救命吧！呵呵 |
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genewind
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2樓2011-07-15 22:30:43
genewind
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3樓2011-07-15 22:36:17
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4樓2011-07-17 09:41:04
云橫秦嶺
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Protocol 3.1 實(shí)驗(yàn)材料 3.1.1材料 第2章提取的mtDNA 3.1.2儀器 Eppendorf 離心機(jī) T-Gradient Thermoblock PCR擴(kuò)增儀（Biometra公司）； Siqu-Gen Cell 38×30垂直電泳儀（Bio-Rad公司）；國(guó)產(chǎn)北京六一廠垂直電泳儀 PowerPca3000電泳電源（Bio-Rad公司）； PowerPca300電泳電源、Bio-Rad公司水平電泳槽（Bio-Rad公司）； 凝膠電泳成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司） 3.1.3 藥品 Tri、EDTA、硼酸、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、超純尿素、PCR相關(guān)試劑為進(jìn)口或進(jìn)口分裝；過硫酸胺、MgCl2、冰醋酸、甲醛、NaOH、Na2CO3、硝酸銀及其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。 3.2 實(shí)驗(yàn)方法 3.2.1 水稻mtDNA基因組的酶切 每個(gè)DNA樣品酶切的混合液包括： DNA（100ng/μl） 5μl MseⅠ 5單位 EcoRI 5單位 Y+/TANGOTMBuffer 8μl 加ddH2O至40μl 37℃酶切2h，65℃酶切2h，85℃滅活15min。 3.2.2 DNA片段接頭的連接 酶切完成的每個(gè)DNA樣品，加入如下反應(yīng)液： EcoRⅠ接頭（5Pmol/μl） 1.0μl MseⅠ接頭（50Pmol/μl） 1.0μl ATP（10mM） 1.0μl T4-DNA連接酶（10U/μl） 0.1μl Y+/TANGOTMBuffer 2.0μl ddH2O 4.9μl 共10μl 22℃連接過夜，取5ul樣品用瓊脂糖電泳檢測(cè)，其余保存?zhèn)溆谩?br /> 3.2.3 引物的篩選 將各種引物分別與已知的mtDNA樣本進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)和選擴(kuò)，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染，觀察特異性條帶，特異性條帶較多(一般3-5個(gè))者，則為較好引物，可用作本實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增引物。 3.2.4 DNA片段的預(yù)擴(kuò)增 連接產(chǎn)物用10mMTris-HCl、0.1mMEDTA（PH8.0）混合液稀釋10倍。再加入如下體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增： DNA： 5μl EcoRⅠ-MR： 0.1μl MseⅠ-MR： 1μl PCR mix： 12.5μl ddH2O ： 6.4μl 共25μl 混合后，在如下PCR條件下擴(kuò)增： step1 94℃ 30sec step2 56℃ 30sec step3 72℃ 1min step4 go to 1 for 30 cycles step5 4℃ forever 預(yù)擴(kuò)增完成后，取5μl預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，在1.0%瓊脂糖凝膠中檢測(cè)預(yù)擴(kuò)增的效果，將余下物-20℃保存。 3.2.5 DNA片段的選擇性擴(kuò)增 預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物加ddH2O稀釋10倍，再按下列體系配制混合液，準(zhǔn)備PCR擴(kuò)增： DNA： 5μl EcoR-P： 0.1μl Mse-P： 1μl dNTPs： 0.5μl 10×buffer： 2.5μl Tap酶： 0.5μl ddH2O： 15.4μl 共25μl PCR擴(kuò)增程序如下： step1 94℃ 30sec step2 65℃ 30sec(-0.7℃/cycle) step3 72℃ 1min step4 go to 1 for 11 cycles step5 94℃ 30sec step6 56℃ 30sec step7 72℃ 1min step8 go to 5 for 22 cycles step9 4℃ forever 3.2.6 聚丙烯酰胺變性凝膠電泳 將玻璃板用洗潔精徹底洗凈，用酒精擦干、干燥。其中一塊玻璃板（底板）涂上1ml剝離硅烷，另一塊玻璃板（蓋板）涂上0.5%親和硅烷（1ml 95％乙醇，5ul冰醋酸，5μl 親和硅烷；涂一塊玻璃板用量用隨配）。操作過程中，嚴(yán)格防止兩塊玻璃板互相污染，電吹風(fēng)吹干，干燥后進(jìn)行電泳槽組裝，組裝時(shí)用水平儀檢測(cè)水平。將6%丙烯酰胺膠儲(chǔ)存液（丙烯酰氨58g、10 × TBE 緩沖液、100ml、尿素480g、甲叉丙稀酰氨、2g）按如下比例配置： 6%PA膠 100ml 10%過硫酸銨（AP） 500μl TEMED 100μl 輕輕搖勻后，迅速將膠沿灌膠口邊灌邊輕輕敲打，防止出現(xiàn)氣泡。待膠流動(dòng)到底部時(shí)，在灌膠口輕輕插入梳子，讓其聚合至少1h（若讓膠過夜，在膠的兩頭鋪上保濕膜或蓋上濕毛巾以防止膠干）。 70W恒功率電泳30min，使膠的溫度高于45℃，清除氣泡。取5l選擴(kuò)產(chǎn)物與等體積變性Loading Buffer（去離子甲酰氨49 ml、0.5 M EDTA1ml、溴酚蘭50mg、二甲苯氰50mg）混合，95℃變性10min后，迅速轉(zhuǎn)移冰浴10min后點(diǎn)樣，70W恒功率電泳至第二條帶（二甲苯氰）至膠板的底沿（約2h）。電泳結(jié)束冷卻后，小心分開兩塊玻璃板，膠會(huì)緊貼涂有親和硅烷的玻璃板上。 3.2.7銀染 脫色：取合適大小的塑料盒，倒入2L新配制的10%冰醋酸溶液(固定/停止液)，輕輕搖動(dòng)5min。 漂洗：用蒸餾水（約2L）浸沒玻璃板在搖床上漂洗膠板3次，每次2分鐘。 染色：染色液（1.5g 硝酸銀加入2L水）中，取出玻璃板快速浸入染色液中，搖床上輕輕搖動(dòng)染色5min。 沖洗：用蒸餾水沖洗膠板不超過5sec。 顯影： 2L顯影液（30gNaOH加入2L水中，事先輕搖使之溶解，）加入37%甲醛8ml，把膠板快速轉(zhuǎn)移到顯影顯影液中，并輕輕搖動(dòng)，直到帶紋出現(xiàn)。 定影：加入10%冰醋酸固定/停止液并輕搖3min。 沖洗：用蒸餾水沖洗2min 干燥：室溫下自然干燥 |
7樓2011-09-30 15:14:07
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