 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 有做AFLP的么？
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1481 | 回復: 6 | |||
| 當前只顯示滿足指定條件的回帖，點擊這里查看本話題的所有回帖 | |||
zhangyonghu木蟲 (小有名氣)
|
[求助]
有做AFLP的么？
|
||
|
最近老師讓做AFLP。我一點也不了解，好做么？我看還得酶切什么的，好像很麻煩的！這個實驗的成功率怎么樣?以后號處理么？ 好心人幫幫我吧，有相關的東西給我發(fā)一下，我的郵箱是：zhangyonghu0815@126.com 謝謝了，就算是救命吧！呵呵 |
回復此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復
-
化學工程及工業(yè)化學論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有98人回復
-
蛋白質檢測：精準分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴謹設計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標南京
已經(jīng)有0人回復
» 本主題相關價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- AFLP酶切連接 求高人指點啊
已經(jīng)有11人回復
- 有誰做過從芐鹵到芐胺的反應，一般怎么做才能發(fā)生反應，溶劑的選擇重要嗎
已經(jīng)有14人回復
- 請問誰做過多聚磷酸和低聚物多元醇的反應啊？急。反應機理是什么啊。
已經(jīng)有5人回復
- 碩士三年雖然一直在做實驗，但沒有做出預期的目標，該怎么辦？如何畢業(yè)？
已經(jīng)有44人回復
- 我照的這個金相 看不懂 請問有做出類似圖像的么？是不是哪里做錯了 請指教
已經(jīng)有19人回復
- 請問有做鋁硅合金的嗎，我想問下鑄造時候氣孔很多怎么消除，還有變質劑的問題
已經(jīng)有8人回復
- 有做過上海人文社科項目的嗎？最后怎么結題的，嚴格嗎？
已經(jīng)有8人回復
- 【求助】求助：請問誰做過鈦酸鋇粒子合成？四氯化鈦怎么防止它吸潮��？
已經(jīng)有7人回復
- 【求助/交流】關于使用AFLP的方法做遺傳多樣性的研究的幾個問題
已經(jīng)有19人回復
wanhscn
木蟲 (職業(yè)作家)
哲學@草根
- MolEPI: 26
- 應助: 53 (初中生)
- 貴賓: 0.87
- 金幣: 3895.7
- 散金: 877
- 紅花: 27
- 沙發(fā): 14
- 帖子: 3642
- 在線: 526.2小時
- 蟲號: 1376762
- 注冊: 2011-08-22
- 性別: GG
- 專業(yè): 植物遺傳學
|
Protocol 3.1 實驗材料 3.1.1材料 第2章提取的mtDNA 3.1.2儀器 Eppendorf 離心機 T-Gradient Thermoblock PCR擴增儀（Biometra公司）； Siqu-Gen Cell 38×30垂直電泳儀（Bio-Rad公司）；國產(chǎn)北京六一廠垂直電泳儀 PowerPca3000電泳電源（Bio-Rad公司）； PowerPca300電泳電源、Bio-Rad公司水平電泳槽（Bio-Rad公司）； 凝膠電泳成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司） 3.1.3 藥品 Tri、EDTA、硼酸、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、超純尿素、PCR相關試劑為進口或進口分裝；過硫酸胺、MgCl2、冰醋酸、甲醛、NaOH、Na2CO3、硝酸銀及其它試劑均為國產(chǎn)分析純。 3.2 實驗方法 3.2.1 水稻mtDNA基因組的酶切 每個DNA樣品酶切的混合液包括： DNA（100ng/μl） 5μl MseⅠ 5單位 EcoRI 5單位 Y+/TANGOTMBuffer 8μl 加ddH2O至40μl 37℃酶切2h，65℃酶切2h，85℃滅活15min。 3.2.2 DNA片段接頭的連接 酶切完成的每個DNA樣品，加入如下反應液： EcoRⅠ接頭（5Pmol/μl） 1.0μl MseⅠ接頭（50Pmol/μl） 1.0μl ATP（10mM） 1.0μl T4-DNA連接酶（10U/μl） 0.1μl Y+/TANGOTMBuffer 2.0μl ddH2O 4.9μl 共10μl 22℃連接過夜，取5ul樣品用瓊脂糖電泳檢測，其余保存?zhèn)溆谩?br /> 3.2.3 引物的篩選 將各種引物分別與已知的mtDNA樣本進行PCR預擴和選擴，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染，觀察特異性條帶，特異性條帶較多(一般3-5個)者，則為較好引物，可用作本實驗的擴增引物。 3.2.4 DNA片段的預擴增 連接產(chǎn)物用10mMTris-HCl、0.1mMEDTA（PH8.0）混合液稀釋10倍。再加入如下體系進行PCR擴增： DNA： 5μl EcoRⅠ-MR： 0.1μl MseⅠ-MR： 1μl PCR mix： 12.5μl ddH2O ： 6.4μl 共25μl 混合后，在如下PCR條件下擴增： step1 94℃ 30sec step2 56℃ 30sec step3 72℃ 1min step4 go to 1 for 30 cycles step5 4℃ forever 預擴增完成后，取5μl預擴增產(chǎn)物，在1.0%瓊脂糖凝膠中檢測預擴增的效果，將余下物-20℃保存。 3.2.5 DNA片段的選擇性擴增 預擴產(chǎn)物加ddH2O稀釋10倍，再按下列體系配制混合液，準備PCR擴增： DNA： 5μl EcoR-P： 0.1μl Mse-P： 1μl dNTPs： 0.5μl 10×buffer： 2.5μl Tap酶： 0.5μl ddH2O： 15.4μl 共25μl PCR擴增程序如下： step1 94℃ 30sec step2 65℃ 30sec(-0.7℃/cycle) step3 72℃ 1min step4 go to 1 for 11 cycles step5 94℃ 30sec step6 56℃ 30sec step7 72℃ 1min step8 go to 5 for 22 cycles step9 4℃ forever 3.2.6 聚丙烯酰胺變性凝膠電泳 將玻璃板用洗潔精徹底洗凈，用酒精擦干、干燥。其中一塊玻璃板（底板）涂上1ml剝離硅烷，另一塊玻璃板（蓋板）涂上0.5%親和硅烷（1ml 95％乙醇，5ul冰醋酸，5μl 親和硅烷；涂一塊玻璃板用量用隨配）。操作過程中，嚴格防止兩塊玻璃板互相污染，電吹風吹干，干燥后進行電泳槽組裝，組裝時用水平儀檢測水平。將6%丙烯酰胺膠儲存液（丙烯酰氨58g、10 × TBE 緩沖液、100ml、尿素480g、甲叉丙稀酰氨、2g）按如下比例配置： 6%PA膠 100ml 10%過硫酸銨（AP） 500μl TEMED 100μl 輕輕搖勻后，迅速將膠沿灌膠口邊灌邊輕輕敲打，防止出現(xiàn)氣泡。待膠流動到底部時，在灌膠口輕輕插入梳子，讓其聚合至少1h（若讓膠過夜，在膠的兩頭鋪上保濕膜或蓋上濕毛巾以防止膠干）。 70W恒功率電泳30min，使膠的溫度高于45℃，清除氣泡。取5l選擴產(chǎn)物與等體積變性Loading Buffer（去離子甲酰氨49 ml、0.5 M EDTA1ml、溴酚蘭50mg、二甲苯氰50mg）混合，95℃變性10min后，迅速轉移冰浴10min后點樣，70W恒功率電泳至第二條帶（二甲苯氰）至膠板的底沿（約2h）。電泳結束冷卻后，小心分開兩塊玻璃板，膠會緊貼涂有親和硅烷的玻璃板上。 3.2.7銀染 脫色：取合適大小的塑料盒，倒入2L新配制的10%冰醋酸溶液(固定/停止液)，輕輕搖動5min。 漂洗：用蒸餾水（約2L）浸沒玻璃板在搖床上漂洗膠板3次，每次2分鐘。 染色：染色液（1.5g 硝酸銀加入2L水）中，取出玻璃板快速浸入染色液中，搖床上輕輕搖動染色5min。 沖洗：用蒸餾水沖洗膠板不超過5sec。 顯影： 2L顯影液（30gNaOH加入2L水中，事先輕搖使之溶解，）加入37%甲醛8ml，把膠板快速轉移到顯影顯影液中，并輕輕搖動，直到帶紋出現(xiàn)。 定影：加入10%冰醋酸固定/停止液并輕搖3min。 沖洗：用蒸餾水沖洗2min 干燥：室溫下自然干燥 |
7樓2011-09-30 15:14:07
genewind
金蟲 (小有名氣)
- 應助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1322.2
- 散金: 2
- 帖子: 198
- 在線: 115.5小時
- 蟲號: 416913
- 注冊: 2007-06-30
- 性別: GG
- 專業(yè): 基因表達調控與表觀遺傳學
2樓2011-07-15 22:30:43
genewind
金蟲 (小有名氣)
- 應助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1322.2
- 散金: 2
- 帖子: 198
- 在線: 115.5小時
- 蟲號: 416913
- 注冊: 2007-06-30
- 性別: GG
- 專業(yè): 基因表達調控與表觀遺傳學
3樓2011-07-15 22:36:17
|
本帖內(nèi)容被屏蔽 |
4樓2011-07-17 09:41:04
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 085600材料與化工調劑 324分 +4 | llllkkkhh 2026-03-18 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 302求調劑 +10 | 呼呼呼。。。。 2026-03-17 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 344求調劑 +5 | knight344 2026-03-16 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0703化學調劑 +4 | pupcoco 2026-03-17 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 268求調劑 +6 | 簡單點0 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
|
[碩博家園] 湖北工業(yè)大學 生命科學與健康學院-課題組招收2026級食品/生物方向碩士 +3 | 1喜春8 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 302求調劑 +9 | 負心者當誅 2026-03-11 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 293求調劑 +6 | 世界首富 2026-03-11 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 290求調劑 +3 | p asserby. 2026-03-15 | 4/200 |
|
|
|
[基金申請] 國自科面上基金字體 +6 | iwuli 2026-03-12 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0854控制工程 359求調劑 可跨專業(yè) +3 | 626776879 2026-03-14 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 285求調劑 +6 | ytter 2026-03-12 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 0703化學調劑 290分有科研經(jīng)歷，論文在投 +7 | 膩膩gk 2026-03-14 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 327求調劑 +6 | 拾光任染 2026-03-15 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 289求調劑 +4 | 這么名字咋樣 2026-03-14 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 328求調劑 +3 | 5201314Lsy！ 2026-03-13 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 266求調劑 +4 | 學員97LZgn 2026-03-13 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料工程調劑 +9 | 咪咪空空 2026-03-12 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 求材料調劑 085600英一數(shù)二總分302 前三科235 精通機器學習 一志愿哈工大 +4 | 林yaxin 2026-03-12 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 301求調劑 +6 | Liyouyumairs 2026-03-11 | 6/300 |
|