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答網(wǎng)友問——關(guān)于生物素標(biāo)記 已有15人參與
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近日有小木蟲蟲友QQ詢問我有關(guān)生物素標(biāo)記的問題，既然已經(jīng)寫了一些回復(fù)，不妨貼出來大家共享吧，也可以繼續(xù)討論 問： 我要在GFP上標(biāo)記BNHS，現(xiàn)在在便宜的BSA上試的，一篇很老的文章上將，可以用DMSO溶BNHS，估計(jì)活化的作用，用硼酸鈉緩沖液（pH8.8）溶BSA，然后放一起4小時(shí)室溫下，接著用NH4Cl除去多余的BNHS，就可以做透析了，我有兩點(diǎn)不明白，BNHS和蛋白的量怎么確定，就是多少個(gè)BNHS接一個(gè)蛋白上？如果BNHS可以和蛋白上的自由氨基結(jié)合，那就是量確定不下來嘍？第二個(gè)是我依稀記得我在Sigma上看到BNHS的推薦pH是6.5-8.5，我用的8.8接近9會(huì)不會(huì)影響標(biāo)記效率，文中用這個(gè)值是不是還有別的考慮��？ 答： 第一，Bio-NHS不需要用DMSO溶，也不需要活化。因?yàn)锽io-NHS本身就是已經(jīng)活化過的生物素，它是可溶于水的，可以直接和蛋白上的氨基進(jìn)行反應(yīng)。而沒有-NHS化的biotin本身是一種不能溶于水的小分子，也不能直接和氨基反應(yīng)。如果買的是biotin的話，才需要將其溶解在DMSO中，在用EDC等進(jìn)行活化，這個(gè)方法不推薦，新手不容易做好，你就直接買活化好的去標(biāo)記就可以了。 第二，標(biāo)記比例按照摩爾數(shù)計(jì)算，被標(biāo)記物：Bio-NHS=1:20是最常用的比例如果要求高的話，可上下2-4倍摸索最佳標(biāo)記比例。Bio-NHS和蛋白表面所有氨基有同等幾率的標(biāo)記機(jī)會(huì)，并不一定標(biāo)記上去的越多越好，不同的蛋白依據(jù)其性質(zhì)會(huì)有差異； 第三：標(biāo)記PH值最好在7.4左右，8.8或9會(huì)一定程度上影響標(biāo)記效率。 問： 那能幫我鑒定下我買的是活化過的么，sigma的H1759-5MG，名字叫Sigma(+)-Biotin N-hydroxysuccinimide ester ，就這一個(gè)問題了，謝謝你。 答： 是的，是活化過的，可以直接標(biāo)記 問： 嗯~~有個(gè)問題，你說標(biāo)記完了，為什么文獻(xiàn)中說要加NH4Cl啊，我想著是把BNHS剩余的反應(yīng)掉，可是反應(yīng)不反應(yīng)有什么作用呢？不反應(yīng)的不能透析出去么 答： 因?yàn)镹HS-biotin的-NHS可以與任何含有氨基的物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，如果不去除的話，在后續(xù)的反應(yīng)中，這些過量未標(biāo)記但有具有標(biāo)記活性的生物素就會(huì)標(biāo)記到你反應(yīng)體系中有氨基的物質(zhì)上，那么在檢測(cè)中就會(huì)造成假陽性或者高本底。生物素這樣的小分子通過透析可以去除大部分，但透析耗時(shí)長(zhǎng)，且要保證去除的干凈，就要多次換液，即使如此，可能還是會(huì)有微量的殘留。但是用摩爾數(shù)超過生物素的其他含氨基的小分子去中和，一方面，耗時(shí)短，另一方面，效果會(huì)好于透析。 |
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