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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 存檔舊帖 » 答網友問——關于生物素標記
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答網友問——關于生物素標記 已有15人參與
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近日有小木蟲蟲友QQ詢問我有關生物素標記的問題，既然已經寫了一些回復，不妨貼出來大家共享吧，也可以繼續(xù)討論 問： 我要在GFP上標記BNHS，現在在便宜的BSA上試的，一篇很老的文章上將，可以用DMSO溶BNHS，估計活化的作用，用硼酸鈉緩沖液（pH8.8）溶BSA，然后放一起4小時室溫下，接著用NH4Cl除去多余的BNHS，就可以做透析了，我有兩點不明白，BNHS和蛋白的量怎么確定，就是多少個BNHS接一個蛋白上？如果BNHS可以和蛋白上的自由氨基結合，那就是量確定不下來嘍？第二個是我依稀記得我在Sigma上看到BNHS的推薦pH是6.5-8.5，我用的8.8接近9會不會影響標記效率，文中用這個值是不是還有別的考慮��？ 答： 第一，Bio-NHS不需要用DMSO溶，也不需要活化。因為Bio-NHS本身就是已經活化過的生物素，它是可溶于水的，可以直接和蛋白上的氨基進行反應。而沒有-NHS化的biotin本身是一種不能溶于水的小分子，也不能直接和氨基反應。如果買的是biotin的話，才需要將其溶解在DMSO中，在用EDC等進行活化，這個方法不推薦，新手不容易做好，你就直接買活化好的去標記就可以了。 第二，標記比例按照摩爾數計算，被標記物：Bio-NHS=1:20是最常用的比例如果要求高的話，可上下2-4倍摸索最佳標記比例。Bio-NHS和蛋白表面所有氨基有同等幾率的標記機會，并不一定標記上去的越多越好，不同的蛋白依據其性質會有差異； 第三：標記PH值最好在7.4左右，8.8或9會一定程度上影響標記效率。 問： 那能幫我鑒定下我買的是活化過的么，sigma的H1759-5MG，名字叫Sigma(+)-Biotin N-hydroxysuccinimide ester ，就這一個問題了，謝謝你。 答： 是的，是活化過的，可以直接標記 問： 嗯~~有個問題，你說標記完了，為什么文獻中說要加NH4Cl啊，我想著是把BNHS剩余的反應掉，可是反應不反應有什么作用呢？不反應的不能透析出去么 答： 因為NHS-biotin的-NHS可以與任何含有氨基的物質進行反應，如果不去除的話，在后續(xù)的反應中，這些過量未標記但有具有標記活性的生物素就會標記到你反應體系中有氨基的物質上，那么在檢測中就會造成假陽性或者高本底。生物素這樣的小分子通過透析可以去除大部分，但透析耗時長，且要保證去除的干凈，就要多次換液，即使如此，可能還是會有微量的殘留。但是用摩爾數超過生物素的其他含氨基的小分子去中和，一方面，耗時短，另一方面，效果會好于透析。 |
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