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friya0910新蟲 (正式寫手)
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[求助]
IPTG誘導(dǎo)
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| 有沒有不加IPTG誘導(dǎo)，也能表達(dá)目的蛋白的情況存在��？我的沒加IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)5h的菌好像也表達(dá)我的目的蛋白了，怎么回事��？ |
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西瓜(金幣+1): 歡迎交流 2011-09-13 11:53:30
西瓜(金幣+1): 歡迎交流 2011-09-13 11:53:30
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同問 我也一樣，1月前表達(dá)的，未加IPTG的無條帶，加入IPTG的有條帶，效果很好。 剛剛拿到誘導(dǎo)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)未加IPTG的和加入的SDS-PAGE一樣，都有目的蛋白條帶。 總結(jié)了網(wǎng)上的說法： 1.IPTG殘留。其不被細(xì)菌代謝，而且我的接種量很大，200ul接種5ml。 2.本底表達(dá)。細(xì)菌產(chǎn)生了IPTG的類似物，就是半乳糖什么的，導(dǎo)致未加IPTG也表達(dá)。 3.菌濃度太高的時(shí)候加入了IPTG，可能由于第一條，這樣，細(xì)菌本身有本地表達(dá)，搖的時(shí)間很長的時(shí)候，本底表達(dá)高，而在OD值高的時(shí)候加入IPTG后，表達(dá)量會降低，所以在SDS-PAGE上顯示差不多 |
9樓2011-09-13 10:40:49
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2樓2011-09-01 19:01:13
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3樓2011-09-01 19:20:46
xbl3688
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【答案】應(yīng)助回帖
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friya0910(金幣+1): 2011-09-01 19:31:00
dhd997(金幣+3): good 2011-09-02 07:00:33
friya0910(金幣+1): 2011-09-01 19:31:00
dhd997(金幣+3): good 2011-09-02 07:00:33
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1、在沒有IPTG誘導(dǎo)劑存在的情況下，細(xì)菌本身當(dāng)然還是會表達(dá)自身蛋白的，但是量比較低； 2、IPTG是β–半乳糖苷酶的活性誘導(dǎo)物質(zhì)，在它的誘導(dǎo)下乳糖被催化形成半乳糖，使lac操縱子處于激活狀態(tài)，從而大量的轉(zhuǎn)錄表達(dá)目的基因； 3、IPTG對細(xì)菌有一定的毒害作用，一般使用濃度為1mM/ml. |
4樓2011-09-01 19:28:13
friya0910
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http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=3538745 上面有我跑的全菌蛋白的圖，麻煩您幫我看看，這圖能說明我的蛋白表達(dá)了嗎？這圖沒跑未加IPTG的菌培養(yǎng)5h的情況，我今天跑的上清和沉淀，發(fā)現(xiàn)未加IPTG的菌培養(yǎng)5h后上清中都有我的目的蛋白，于是我就困惑了……等脫完色把圖傳上來讓您幫我看看，成嗎？ |
5樓2011-09-01 19:30:36
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6樓2011-09-01 19:42:54
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7樓2011-09-01 20:18:27
【答案】應(yīng)助回帖
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dhd997(金幣+5, MolEPI+1): 再接再厲、 2011-09-02 07:00:58
friya0910(金幣+2): 2011-09-04 14:59:15
dhd997(金幣+5, MolEPI+1): 再接再厲、 2011-09-02 07:00:58
friya0910(金幣+2): 2011-09-04 14:59:15
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最近準(zhǔn)備做pET系統(tǒng)的表達(dá)，查了一些資料。發(fā)現(xiàn)pET的誘導(dǎo)表達(dá)有兩種情況：①監(jiān)測OD值，0.5~0.6時(shí)添加IPTG的誘導(dǎo)，②使用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基。 關(guān)于自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，你可以看一下這個(gè)帖子：”PET系統(tǒng)蛋白表達(dá)自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基、大幅度提高產(chǎn)量“，在很多網(wǎng)站上有轉(zhuǎn)載。 對于你的問題，這篇帖子中有描述：【但為了解決表達(dá)型質(zhì)粒的自發(fā)誘導(dǎo)的問題（就是不加誘導(dǎo)劑，菌液搖到飽和時(shí)總有目的蛋白自動表達(dá)的問題，這也是有毒蛋白不能表達(dá)的原因），他徹底研究了培養(yǎng)基的每一種組分，最后發(fā)現(xiàn)是胰蛋白胨里的少量的乳糖在作怪，他同時(shí)又發(fā)現(xiàn)了葡萄糖，和氨基酸能抑止乳糖的誘導(dǎo)，在培養(yǎng)基的研究中，他發(fā)明了全新的培養(yǎng)基組分，在這種培養(yǎng)基里，菌液的OD值很簡單的就能達(dá)到5－50左右，在此基礎(chǔ)上，他發(fā)明了自動誘導(dǎo)系統(tǒng)。】 自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，studier文獻(xiàn)中的配方感覺太復(fù)雜，尤其18 種aa。 我再網(wǎng)上找到了中簡單的配方，組成： Autoclave /1L - Phosphate Buffer (pH 7.2) 6g Na2HPO4/3g KH2PO4 - Tryptone 20 g - Yeast Extract 5 g - NaCl 5 g Filter sterilise - 60 % v/v Glycerol 10 ml - 10 % w/v Glucose 5 ml - 8 % w/v Lactose 25 ml 我要等兩天做表達(dá)， 對于這個(gè)配方不知道你有沒有興趣， 有興趣的話，可以交流一下此配方的 表達(dá)效果。 |
8樓2011-09-01 21:08:47
臨風(fēng)7071
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10樓2011-09-17 22:54:15
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