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wjb6681393金蟲 (小有名氣)
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[求助]
做枯草芽孢桿菌感受態(tài)用什么方法好？要詳細(xì)步驟，謝謝
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 我看有的方法用的水解酪蛋白，用哪個(gè)公司的好？ |
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shuangzi8761
銀蟲 (著名寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+5): Good！ 2011-11-17 19:36:17
wjb6681393(金幣+40): thanks 2011-12-09 19:14:42
西瓜(金幣+5): Good！ 2011-11-17 19:36:17
wjb6681393(金幣+40): thanks 2011-12-09 19:14:42
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1）接種B . subtilis于3mlLB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng).。 2）取2.6ml過夜培養(yǎng)物接入40ml（LB+0.5M 山梨醇）中，37℃，200rpm培養(yǎng)至OD600=0.85~0.95. 3）將菌液冰水浴10 min，然后5000g，5 min，4℃離心收集菌體。 4）用50ml預(yù)冷的電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖），重新吹懸菌體，5000g，5min，4℃離心去上清，如此漂洗4次。 5）將洗滌后的菌體吹懸于1ml電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基中，每EP管分裝120。 6）將60μl感受態(tài)細(xì)胞中加入50ngDNA（1~8μl），冰上孵育2min，加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯（1mm）中，電擊一次。 電轉(zhuǎn)儀設(shè)置：2.0kv,1mm,電擊1次。（電擊結(jié)果：時(shí)間常數(shù)=4.5~5.0ms,如果時(shí)間常數(shù)<4.2 ,則需要增加電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基的漂洗次數(shù)或者提高感受態(tài)的稀釋倍數(shù)來獲得更高的轉(zhuǎn)化效率） 7）電擊完畢取出杯子并立即加入1ml RM（LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），37℃，200rpm，復(fù)蘇3h后，涂板。37℃，過夜培養(yǎng)。 準(zhǔn)備 40ml（LB+0.5M山梨醇）：蛋白胨10g/l , 酵母粉5g/l , NaCl 10g/l , 3.6g山梨醇pH=7.2 200ml電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖）：18g 山梨醇，18.5g甘露醇，20g葡萄糖。 10ml RM（0.5M山梨醇，0.38M甘露醇）：0.9g山梨醇，0.7g甘露醇。 2個(gè)50ml離心管，滅菌。 我做芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化 這個(gè)是之前大神告訴我的方法 |
3樓2011-11-17 17:05:21
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金幣+5): 很熱心 2011-09-12 08:25:05
dhd997(金幣+5): 很熱心 2011-09-12 08:25:05
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這是我在網(wǎng)上看見的，別人發(fā)的方法不知有用沒，還沒試呢 ①取受體菌接種于BY培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)到對數(shù)生長早中期。此時(shí)OD620應(yīng)在0.4左右，培養(yǎng)時(shí)間約為4～5小時(shí)。 ②將培養(yǎng)后的菌液離心，棄去上清液，再用生長培養(yǎng)基（GM液）洗菌一次，然后將菌體細(xì)胞重新懸浮在與BY培養(yǎng)液等體積的GM液中。37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)到對數(shù)生長后期。此時(shí)OD620應(yīng)在0.6～0.9，培養(yǎng)時(shí)間約為3～5小時(shí)。 ③以1:10的比例將GM液中培養(yǎng)的菌液稀釋于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基（TM液）中。即取菌液0.2ml加入1.8mlTM液中，在20×150mm的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)90分鐘。 ④加入供體質(zhì)粒，至最終濃度1ug/ml，于20×150mm的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)30分鐘。 ⑤取200ul涂布抗性選擇平板，37℃培養(yǎng)48小時(shí)。 【培養(yǎng)基配方】 A. BY培養(yǎng)基：牛肉膏5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，葡萄糖5g，蒸餾水1000ml，pH7.5。 B. 1×最低鹽溶液：K2HPO4 14g（K2HPO4•3H2O 18.34g），K2HPO4 6g，(NH4)2SO4 2g，檸檬酸鈉（Na3C6H5O7•2H2O）1g，MgSO4•7H2O 0.2g，在蒸餾水中依次溶解，加水至1000ml。 C. L- trp溶液，2mg/ml，貯于棕色瓶內(nèi)，用黑紙包裹。（過濾滅菌） D. 生長培養(yǎng)基：GM，使用時(shí)混合比例。1×最低鹽溶液100ml，1M硫酸鎂0.5ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.4ml，10%酵母汁1ml，L-trp 50ug/ml。 E. 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基：TM，使用時(shí)混合比例。1×最低鹽溶液100ml，1M硫酸鎂0.5ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.2ml，L-trp 5ug/ml。 其中 50% 葡萄糖 過濾滅菌 5%水解酪蛋白和10%酵母汁均可高溫滅菌 至于載體你可以試試 pAX01這是一個(gè)適用于芽孢桿菌屬的過表達(dá)載體 |
2樓2011-09-08 11:34:15
4樓2014-01-10 16:59:42
5樓2014-01-11 22:16:43
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