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flylove037新蟲 (小有名氣)
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[求助]
PCR高手請進，小女子有事相求，我剛來金幣不要嫌少啊，我只有這么多啊，全給你了
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最近做PCR很受傷，以前P出來的體系做了很多次，出結(jié)果的概率很低。中途PCR反應(yīng)試劑用完了，重新訂購的（takara），引物什么的也重新訂購的，同樣的序列同一個公司。然后重新優(yōu)化PCR體系，結(jié)果如圖：1、3、5、7、9是加了模板的，2、4、6、8、10沒加，兩兩體系是一樣的除了加模板和沒加模板；所有試劑都一樣，做了一個Mg離子梯度：2、3、4、5、6微升，原以為找到了原因，今天用6微升Mg離子的做了4批，一管都沒有，桑心啊~~~哪位高人可以幫幫我啊，小女子不甚感激啊~~~~~ 試劑什么的應(yīng)該沒有問題的，因為其他同學(xué)做別的分子標(biāo)記也做得出的。 |
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wanhscn
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金幣+5, MolEPI+1): 2011-09-07 11:15:48
dhd997(金幣+2): 樓主獎勵 2011-09-07 17:20:33
dhd997(金幣+5, MolEPI+1): 2011-09-07 11:15:48
dhd997(金幣+2): 樓主獎勵 2011-09-07 17:20:33
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Troubleshooting discussion is based on the PCR protocol as described in the table below. All reactions are run for 30 cycles. From Yale University （這個是我以前做等位特異PCR的時候參考過，你可以參照問題3 ） 1. I get (many) longer unspecific products. What can I do? 擴增出比較長的非特異性產(chǎn)物？ Decrease annealing time減少退火時間 Increase annealing temperature升高退火溫度 Decrease extension time減少延伸時間 Decrease extension temperature to 62-68º C降低延伸溫度到62-68º C Increase KCl (buffer) concentration to 1.2x-2x, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mM.增加KCl濃度到1.2-2.0倍，但是保持MgCl2濃度在1.5-2.0mM Increase MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constant.增加MgCl2濃度到3-4.5 mM，但是保持dNTP濃度不變。 Take less primer減少引物 Take less DNA template減少DNA模板濃度 Take less Taq polymerase少用些Taq酶 If none of the above works: check the primer for repetitive sequences (BLAST align the sequence with the databases) and change the primer(s)如上訴無效果：核對引物的重復(fù)序列和換引物 Combine some/all of the above 上訴方法靈活使用 -------------------------------------------------------------------------------- 2. I get (many) shorter unspecific products. What can I do? 擴增出比較短的非特異性產(chǎn)物 Increase annealing temperature升高退火溫度 Increase annealing time增加退火時間 Increase extension time增加延伸時間 Increase extension temperature to 74-78º C增加延伸溫度到74-78º C Decrease KCl (buffer) concentration to 0.7-0.8x, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mM減少KCl濃度至0.7-0.8倍，但是保持MgCl2濃度在1.5-2mM Increase MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constant增加MgCl2濃度到3-4.5 mM但是保持dNTP濃度不變 Take less primer少用引物 Take less DNA template少用模板 Take less Taq polymerase少用酶 If none of the above works: check the primer for repetitive sequences (BLAST align the sequence with the databases) and change the primer(s)同第一問題 Combine some/all of the above -------------------------------------------------------------------------------- 3. Reaction was working before, but now I can't get any product. 反應(yīng)以前有產(chǎn)物，可是現(xiàn)在不行。 Make sure all PCR ingredients are taken in the reaction (buffer, template, Taq, etc)確保反應(yīng)所有的成分都存在 Change the dNTP solution (very sensitive to cycles of thawing and freezing, especially in multiplex PCR)更換dNTP溶液 If you just bought new primers, check for their reliability (bad primer synthesis ?)新引物要保持其合成的準(zhǔn)確可靠性 Increase primer amount增加引物的量 Increase template amount增加模板的量 Decrease annealing temperature by 6-10º C and check if you get any product. If you don't, check all your PCR ingredients. If you do get products (including unspecific ones) reaction conditions as described above.將退火溫度降低6-10º C后核對一下是否有產(chǎn)物，如果沒有就確認(rèn)一下PCR反應(yīng)的成分是否都存在。如果能獲得產(chǎn)物（包括非特異性的產(chǎn)物）然后采取上訴方法。 Combine some/all of the above 4. My PCR product is weak. Is there a way to increase the yield? PCR的產(chǎn)物的量很少，怎樣增加產(chǎn)量? -------------------------------------------------------------------------------- Gradually decrease the annealing temperature to the lowest possible.逐漸降低退火溫度到最大可能 Increase the amount of PCR primer增加引物的量 Increase the amount of DNA template增加模板的量 Increase the amount of Taq polymerase增加酶的量 Change buffer (KCl) concentration (higher if product is lower than 1000bp or lower if product is higher than 1000bp)改變buffer中KCL的濃度（增加如果產(chǎn)物少于1000bp，減少如果大于1000bp） Add adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8 µg/µL final concentration). You can also try 5% (v/v, final concentration) DMSO or glycerol.加入輔佐劑。最好用BSA。或者用5%的二甲基亞砜 Check primer sequences for mismatches and/or increase the primer length by 5 nucleotides核對一下一物種錯配的，或者增加5個核苷酸 Combine some/all of the above 5. My two primers have very different melting temperatures (Tm) but I cannot change their locus. What can I do to improve PCR amplification? 兩個引物的溶解溫度非常不一樣但不能改變基因座。如何改進？ -------------------------------------------------------------------------------- An easy solution is to increase the length of the primer with low Tm. If you need to keep the size of the product constant, add a few bases at the 3' end. If size is not a concern, add a few bases at either the 3' or the 5' end of that primer.增加低溶解溫度的長度。 [ Last edited by wanhscn on 2011-9-6 at 22:32 ] |
4樓2011-09-06 22:23:33
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【答案】應(yīng)助回帖
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wanhscn(金幣+3): 我也經(jīng)常用你這個體系。 2011-09-06 22:20:01
wanhscn(金幣+3): 我也經(jīng)常用你這個體系。 2011-09-06 22:20:01
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6ul mg？多大體系？通常我的PCR 20ul的話，是2.5ul ~3 ul之間， 看上去你選那個 4 ul的就不錯啊。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
flylove0373樓2011-09-06 21:33:20
wanhscn
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dhd997(金幣+3): good 2011-09-12 08:24:05
dhd997(金幣+3): good 2011-09-12 08:24:05
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優(yōu)化的時候是怎么優(yōu)化的？是用移液器一個PCR管一個PCR管的加反應(yīng)試劑，還是配5-10個反應(yīng)的反應(yīng)液，然后混合再加；前者單個加，尤其是酶加不準(zhǔn)。加6微升鎂離子，感覺太多了。 再做一次，注意不能漏加。我看3ul就差不多。 |
2樓2011-09-06 21:25:15
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
dhd997(金幣+2): 鼓勵交流 2011-09-07 11:19:08
dhd997(金幣+2): 鼓勵交流 2011-09-07 11:19:08
| 看不到圖，不知道你鎂離子的濃度是多少6ul的話，一般是25mm的，再加上你的體系可能是25ul的？那終濃度就是6mm，對于普通PCR來說雖然有點高，但是不至于會擴不出來 |
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5樓2011-09-07 09:13:32
imfly77
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西瓜(金幣+3): 深表同意！做分子4年多，本人和身邊的人從來沒優(yōu)化過鎂離子濃度！ 2011-09-07 15:42:05
西瓜(金幣+3): 深表同意！做分子4年多，本人和身邊的人從來沒優(yōu)化過鎂離子濃度！ 2011-09-07 15:42:05
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話說我讀博士的時候，我老板最看不起國內(nèi)一些研究生的就是做PCR喜歡優(yōu)化Mg離子濃度，深以為然。 用哪種酶就用那種酶配的緩沖液，按protocol上給的標(biāo)準(zhǔn)體系和程序加樣和反應(yīng)，除了某些高GC體系需要注意，一般的PCR反應(yīng)都不會有什么問題。如果出問題了，檢查自己的程序是否有錯誤，檢查反應(yīng)體系中是否加錯或者漏加，是否拿錯了反應(yīng)buffer——很容易發(fā)生的錯誤是把dNTP加錯，因為有時候也可能用dCTP或者dTTP，以及把buffer加錯（默認(rèn)的緩沖buffer都是帶有Mg2+的，但不排除有不帶Mg的，這類buffer都會注明-Mg2+）。 別把自己的時間浪費在這種低質(zhì)量、繁瑣的優(yōu)化上，要相信這部分優(yōu)化商家已經(jīng)幫你做好了——以前曾聽說有個同學(xué)做了兩個學(xué)期的PCR條件優(yōu)化，最后寫了一篇論文就是關(guān)于怎樣做好PCR，讓人無語。 |
6樓2011-09-07 13:53:52
flylove037
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7樓2011-09-07 14:18:44
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是因為試了很多情況都做不出來才迫不得已優(yōu)化的啊，誰會沒事找抽搞體系優(yōu)化啊，我們導(dǎo)師也很藐視方法上的所謂改進的，把這個方法寫進文章這種事情是做不出來的，那個只是我們試驗中的困難，你舉的那個例子就太夸張了。你提的建議有一定的參考價值，因為當(dāng)時做出來的時候就是按說明書上的體系很輕松就出來了，可是現(xiàn)在又做不出了，卻找不出原因，dNTP加錯應(yīng)該不可能，因為我們實驗室只有一種，而且我們實驗室一直用的是Mg+（-）的這種buffer，直接加了Mg+的buffer也有的，但用的少。感謝你給我這種化繁為簡的思路，謝謝！ |
8樓2011-09-07 14:32:27
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9樓2011-09-07 14:37:19
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