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huojinlong9287銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
漢譯英 生物學方向
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| 為了構(gòu)建綠色熒光蛋白AcGFP1基因的原核表達載體pET32a-AcGFP1，并通過誘導使其在大腸桿菌中高效表達，本研究以pIRES-AcGFP1質(zhì)粒為模板，采用PCR技術(shù)特異性擴增綠色熒光蛋白（AcGFP1）基因，并通過酶切和連接使其與原核表達載體pET32a（+）構(gòu)成重組子，經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定后，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3），用不同濃度的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導表達綠色熒光蛋白，并通過15%SDS-PAGE鑒定。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pET32a-AcGFP1中的AcGFP1序列與Clontech公司的pIRES-AcGFP1質(zhì)粒的AcGFP1序列完全一致，說明成功構(gòu)建了含有綠色熒光蛋白AcGFP1的原核表達質(zhì)粒。pET32a-AcGFP1轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞Rosetta（DE3）后，經(jīng)不同濃度的IPTG誘導后均獲得高效表達。SDS-PAGE驗證的目的蛋白相對分子量約為44000Da，與理論預期值相符。 |
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| The aim of this study was to construct prokaryotic expression vector pET32a-AcGFP1, and its high level expression in E. coli cell. AcGFP1 gene was amplified from vector pIRES-AcGFP1 by PCR method, and was inserted into prokaryotic expression vector pET32a(+). The resulting pET32a-AcGFP1 was transformed into E. coli Rosetta(DE3) for expression followed by induction with isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Whole-cell extracts were separated on 15% SDS-PAGE. AcGFP1 gene in pET32a-AcGFP1 was consistent with related gene in pIRES-AcGFP1 from Clontech Ltd, indicating prokaryotic expression vector with AcGFP1 gene was constructed successfully. High level expression was conducted with transformed E. coli Rosetta(DE3) after IPTG induction. A strong induction of a 44 kD protein was detected in SDS-PAGE, which was in correspondence with the theoretic value. |
2樓2011-09-09 11:18:49
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