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納蘭欣光

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[交流] 3‘RACE inner PCR 電泳結(jié)果總是有彌散現(xiàn)象回收條帶不成帶狀什么原因啊？已有11人參與

采用65度退火溫度跑兩輪3‘RACE PCR 電泳條帶多條，并且最大的條帶上面很大的彌散帶，用的是TAKARA 3‘RACE試劑盒，設(shè)計(jì)兩條上游特異性引物相差117bp,設(shè)計(jì)原則按照說(shuō)明書(shū)來(lái)的，想問(wèn)問(wèn)做過(guò)3‘RACE的前輩們，這到底什么原因��？圖1為pcr結(jié)果，圖2為切膠回收結(jié)果。

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【求助/交流】PCR引物設(shè)計(jì)出來(lái)了，但酶切之后電泳沒(méi)條帶啊已經(jīng)有18人回復(fù)

1樓 2011-09-09 09:10:34

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linqin1029

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wanhscn(金幣+3): Good！ 2011-09-09 16:33:02

怎么，我看不了你的圖片�。� 我提幾點(diǎn)建議吧！
1、3‘RACE 的引物一般在60度以上，而且兩條引物TM值要相差幾度。以便改變兩輪PCR的退火溫度。
2、兩輪巢式PCR的退火溫度也要有差異，第二輪PCR退火溫度要比第一輪高。以便減少非特異性擴(kuò)增。
3、第一輪的PCR循環(huán)數(shù)25輪就OK拉，以便減少非特異擴(kuò)增。
4、第一輪PCR的產(chǎn)物一般稀釋5~20倍作為第二輪PCR的模板，以便減少非特異的產(chǎn)物模板。

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2樓2011-09-09 10:00:52

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換盒子－－－ｃｌｏｔｈｔｅｃｈ，用過(guò)的都說(shuō)好

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3樓2011-09-09 14:55:33

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dhd997: 引用回復(fù)，他會(huì)看到你的提問(wèn)的 2011-09-10 07:49:30

謝謝前輩的回答！提取的總RNA 中有基因組DNA 污染會(huì)造成這樣的結(jié)果嗎？

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4樓2011-09-09 16:07:14

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wanhscn

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dhd997(金幣+3): good 2011-09-09 18:13:26

引用回帖:

4樓: Originally posted by 納蘭欣光 at 2011-09-09 16:07:14:
謝謝前輩的回答！提取的總RNA 中有基因組DNA 污染會(huì)造成這樣的結(jié)果嗎？

那可能是兩條帶，一個(gè)cDNA擴(kuò)出來(lái)的，一個(gè)是基因組擴(kuò)出來(lái)的（如果有內(nèi)含子），不會(huì)出現(xiàn)這種模糊。
一般不是用DNase消化過(guò)嗎，污染的可能性不高吧。
可以參照沙發(fā) 的回答！

[ Last edited by wanhscn on 2011-9-9 at 16:32 ]

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5樓2011-09-09 16:29:51

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zheng20089829

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wanhscn:編輯內(nèi)容 2011-09-09 18:03
wanhscn(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2011-09-09 18:06:27

我用的是clonetech的盒子，用梯度降低退火溫度試試（touch down）彌散我覺(jué)得問(wèn)題也不大，你那個(gè)帶還可以的，直接割膠去測(cè)序好了

[ Last edited by wanhscn on 2011-9-9 at 18:03 ]

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6樓2011-09-09 17:28:54

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引用回帖:

6樓: Originally posted by zheng20089829 at 2011-09-09 17:28:54:
我用的是clonetech的盒子，用梯度降低退火溫度試試（touch down）彌散我覺(jué)得問(wèn)題也不大，你那個(gè)帶還可以的，直接割膠去測(cè)序好了
[ Last edited by wanhscn on 2011-9-9 at 18:03 ]

你覺(jué)得他挖帶回收的那個(gè)帶是不是很弱？還不如PCR產(chǎn)物直接過(guò)柱后拿去測(cè)序？

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7樓2011-09-09 18:06:07

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我也是用的TAKARA 3‘RACE試劑盒，你可以一輪PCR的時(shí)候做一個(gè)梯度，選出最佳溫度，再擴(kuò)二輪，一般來(lái)說(shuō)特異引物擴(kuò)增第二輪的時(shí)候都只有一個(gè)帶了！

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8樓2011-09-09 20:11:26

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前一次切膠回收后轉(zhuǎn)化鏈接，做的菌落PCR用的引物還是第二次PCR的引物，可是結(jié)果出來(lái)都是比較小的片段，直接送去菌液測(cè)序結(jié)果為沒(méi)有信號(hào)，所以我就認(rèn)為是切膠回收的帶像是彌散而不是單一帶了，沒(méi)有信號(hào)是濃度太小還是用引物也沒(méi)有測(cè)序出結(jié)果呢？

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9樓2011-09-09 22:14:50

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引用回帖:

9樓: Originally posted by 納蘭欣光 at 2011-09-09 22:14:50:
前一次切膠回收后轉(zhuǎn)化鏈接，做的菌落PCR用的引物還是第二次PCR的引物，可是結(jié)果出來(lái)都是比較小的片段，直接送去菌液測(cè)序結(jié)果為沒(méi)有信號(hào)，所以我就認(rèn)為是切膠回收的帶像是彌散而不是單一帶了，沒(méi)有信號(hào)是濃度太小還 ...

像這樣，利用引用回復(fù)，會(huì)給被引用的人一個(gè)提示，可以及時(shí)反饋你的問(wèn)題

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人生不過(guò)幾十年，成敗榮辱都在天，是非恩怨莫在意，健康快樂(lè)最值錢(qián)，自古人間苦無(wú)邊，看得高遠(yuǎn)境如仙，愿你不為凡事惱，輕松快樂(lè)每一天。

10樓2011-09-10 07:50:29

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