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yesucao木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[交流]
電擊轉(zhuǎn)化
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| 目前實(shí)驗(yàn)需求，要求采用電擊法轉(zhuǎn)化10.2kb質(zhì)粒到枯草芽孢桿菌中，實(shí)驗(yàn)室沒(méi)人做過(guò)，質(zhì)粒有點(diǎn)大，知道有難度，所以特來(lái)取經(jīng)，不知道有什么需要注意的地方嗎？？？還請(qǐng)各位大蝦幫忙��！ |
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 實(shí)驗(yàn)技術(shù)、方法交流 | 【分子生物】EPI帖 |
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yesucao
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2樓2011-09-10 15:38:09
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小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
wanhscn(金幣+4): 辛苦！ 2011-09-10 17:17:08
amisking(MolEPI+1): 2011-09-10 23:12:19
yesucao(金幣+5): 謝謝你給的材料，我會(huì)認(rèn)真參考的 2011-09-13 09:45:15
小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
wanhscn(金幣+4): 辛苦！ 2011-09-10 17:17:08
amisking(MolEPI+1): 2011-09-10 23:12:19
yesucao(金幣+5): 謝謝你給的材料，我會(huì)認(rèn)真參考的 2011-09-13 09:45:15
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電擊時(shí)，鹽要洗干凈，不然電流過(guò)大會(huì)爆杯 這有個(gè)protocol可以參考一下 第一天： 1. 將適合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上，在37°C下過(guò)夜培養(yǎng) 2. 高溫滅菌大的離心瓶（250-500ml）以備第二天搖瓶用 3. 準(zhǔn)備幾瓶滅菌水（總量約1.5升），保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細(xì)胞用 第二天： 4. 轉(zhuǎn)移0.2-1ml過(guò)夜培養(yǎng)物至裝有500ml LB（或其他營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基）的1-2升擋板搖瓶中 5. 37°C下劇烈振蕩培養(yǎng)2-6小時(shí) 6. 定時(shí)監(jiān)控O.D.600值（培養(yǎng)1小時(shí)后每半小時(shí)測(cè)定一次） 7. 當(dāng)O.D.600值達(dá)到0.5-1.0時(shí)，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻至少15分鐘（需要的話(huà)這種方式可以存放培養(yǎng)液數(shù)小時(shí)） 8. 細(xì)胞在4°C 5000g下離心15分鐘，棄上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一兩天） 9. 用滅菌的冰水重懸浮細(xì)胞。先用渦旋儀或吸液管重懸浮細(xì)胞于少量體積中（幾毫升），然后加水稀釋至離心管的2/3體積。 10. 照上面步驟重復(fù)離心，小心棄去上清液 11. 照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細(xì)胞 12. 離心，棄上清液 13. 用20ml滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細(xì)胞 14. 照上面步驟離心，小心棄去上清液（沉淀可能會(huì)很松散） 15. 用10%甘油重懸浮細(xì)胞至最終體積為2-3ml 16. 將細(xì)胞按150μl等份裝入微量離心管，于-80°C保存 轉(zhuǎn)化方法: 1. 在冰上解凍電感受態(tài)細(xì)胞添加1-10μl DNA ，冰上培育約5分鐘 2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育約5分鐘 3. 轉(zhuǎn)移DNA/細(xì)胞混合物至冷卻后的2mm電穿孔容器（無(wú)泡）中 4. 加載P1000，準(zhǔn)備好300μl LB 或 2xYT 5. 對(duì)電穿孔容器進(jìn)行脈沖（200 歐姆, 25μFd, 2.5 千伏）（檢查時(shí)間常數(shù)，應(yīng)該在3以上） 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至電穿孔容器中 7. 37°C下培養(yǎng)細(xì)胞40分鐘至1小時(shí)以復(fù)原 8. 轉(zhuǎn)移細(xì)胞至適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)基上培養(yǎng) |
3樓2011-09-10 16:39:36
yesucao
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我還想問(wèn)你一些問(wèn)題： 1、 制備感受態(tài)懸浮用的水是什么水？？我看的文獻(xiàn)是用緩沖液來(lái)懸浮細(xì)胞，比如蔗糖加甘油或者一些專(zhuān)用的緩沖液？ 2、 一次性制備這么多的感受態(tài)能放多久？？不是現(xiàn)配現(xiàn)用的嗎？？每一次電擊前都要制備一次感受態(tài)嗎？？ 3、 轉(zhuǎn)化方法中，加載P1000是什么意思？這個(gè)看不懂 4、 我想一次做多個(gè)電擊轉(zhuǎn)化，電擊杯不是要滅菌嗎？這樣是不是我要一次滅菌幾個(gè)滅菌杯？？ 5、 這個(gè)溫度怎么是37度？？不是根據(jù)自己的受體菌溫度來(lái)定的嗎？？我的是枯草芽孢桿菌，溫度是在30度培養(yǎng)最好。 |
4樓2011-09-13 09:41:25
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