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[求助]
定量的若干問題，求解答！
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各位大俠，我要做定量了，還有很多細(xì)節(jié)不太明白，請大家?guī)兔饣蟀 ? 我做的是細(xì)菌，我想知道某一功能基因在某一特殊處理下的表達(dá)量與未處理時的差異。這應(yīng)該是相對定量吧。 問題一，做定量是要設(shè)置內(nèi)參的，是吧？而我查到的資料基本都是做真核的，“常用的內(nèi)參基因是beta-actin，GADPH，rRNA基因等”，這句話在很多資料中出現(xiàn)。但是我的材料是細(xì)菌，是原核生物，用什么做為內(nèi)參呢？按說GAPDH和rRNA基因都可以，是吧？但是，因為我的菌株是未知菌，我根本不知道它的GAPDH基因序列，所以無法自己設(shè)計引物，我想是不是這些常用內(nèi)參的引物是通用的呢，結(jié)果我查到的是，不同物種的都不一樣，所以好像我就不能用GADPH做內(nèi)參了吧。好在我對它的16S rDNA已經(jīng)進(jìn)行了測序，得到了序列。請問我是否應(yīng)該用16S做內(nèi)參呢？ 問題二，如何進(jìn)行引物設(shè)計呢？我指的是用什么軟件好一些？我看到做定量對引物的要求很高。我需要設(shè)計兩對引物，內(nèi)參的和目的基因的。而且，兩個基因的擴(kuò)增片段大小應(yīng)該基本差不多，是吧？200bp左右最好？ 問題三，標(biāo)準(zhǔn)曲線到底用什么做？我現(xiàn)在有幾個概念比較混亂，實驗組、對照組、標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)參、目的基因。標(biāo)準(zhǔn)曲線是要拿標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增內(nèi)參基因得到的嗎？還是拿標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增目的基因得到的？另外，我的實驗中標(biāo)準(zhǔn)品是什么？ 問題四，我看到相對定量方法有兩種：deltadelta Ct法和雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，我用哪種好呢？deltadelta Ct法結(jié)果需要得到四個Ct值，好像這四個值是在一次定量PCR中得到的，是嗎？也就是說，我對實驗組和對照組都需要同時進(jìn)行內(nèi)參基因和目的基因的擴(kuò)增？而雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法需要對內(nèi)參基因和目的基因分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線，是用對照組擴(kuò)增兩個基因得到嗎？ 在線等！求詳解！多謝了…… [ Last edited by dhd997 on 2011-9-13 at 07:51 ] |
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西瓜(金幣+1): 版主很熱心啊 2011-09-13 11:57:07
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2樓2011-09-13 08:27:16
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【答案】應(yīng)助回帖
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西瓜(金幣+3, MolEPI+1): 居然漏評了，失職失職…… 2011-11-01 17:51:35
西瓜(金幣+3, MolEPI+1): 居然漏評了，失職失職…… 2011-11-01 17:51:35
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1.關(guān)于引物設(shè)計，現(xiàn)在常用的引物設(shè)計軟件都可以。 2.關(guān)于定量方法：有相對定量和絕對定量兩種，絕對定量需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，所以要用到標(biāo)準(zhǔn)品，所謂的標(biāo)準(zhǔn)品就是你要擴(kuò)增的片段，并且要能確定它的拷貝數(shù)，因此標(biāo)準(zhǔn)品的制備是比較困難的；另一種就是相對定量，這種方法通過把參照Ct值調(diào)整到同一水平從而來校正兩個樣本的Ct值，然后對校正后的Ct值進(jìn)行比較分析，根據(jù)你的描述做相對定量就可以了，所以沒必要制備標(biāo)準(zhǔn)品。 3.關(guān)于內(nèi)參，原則上只要能保證這個參照在不同樣本中的穩(wěn)定性就可以，具體選什么還是多查查資料 |
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夢想起飛7樓2011-09-14 11:10:05
8樓2011-11-01 16:52:25
tanaluck
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9樓2012-03-14 14:22:27
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10樓2012-07-19 01:34:05
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