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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 定量的若干問題，求解答！
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[求助]
定量的若干問題，求解答！
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各位大俠，我要做定量了，還有很多細節(jié)不太明白，請大家?guī)兔饣蟀 ? 我做的是細菌，我想知道某一功能基因在某一特殊處理下的表達量與未處理時的差異。這應該是相對定量吧。 問題一，做定量是要設置內參的，是吧？而我查到的資料基本都是做真核的，“常用的內參基因是beta-actin，GADPH，rRNA基因等”，這句話在很多資料中出現。但是我的材料是細菌，是原核生物，用什么做為內參呢？按說GAPDH和rRNA基因都可以，是吧？但是，因為我的菌株是未知菌，我根本不知道它的GAPDH基因序列，所以無法自己設計引物，我想是不是這些常用內參的引物是通用的呢，結果我查到的是，不同物種的都不一樣，所以好像我就不能用GADPH做內參了吧。好在我對它的16S rDNA已經進行了測序，得到了序列。請問我是否應該用16S做內參呢？ 問題二，如何進行引物設計呢？我指的是用什么軟件好一些？我看到做定量對引物的要求很高。我需要設計兩對引物，內參的和目的基因的。而且，兩個基因的擴增片段大小應該基本差不多，是吧？200bp左右最好？ 問題三，標準曲線到底用什么做？我現在有幾個概念比較混亂，實驗組、對照組、標準品、內參、目的基因。標準曲線是要拿標準品擴增內參基因得到的嗎？還是拿標準品擴增目的基因得到的？另外，我的實驗中標準品是什么？ 問題四，我看到相對定量方法有兩種：deltadelta Ct法和雙標準曲線法，我用哪種好呢？deltadelta Ct法結果需要得到四個Ct值，好像這四個值是在一次定量PCR中得到的，是嗎？也就是說，我對實驗組和對照組都需要同時進行內參基因和目的基因的擴增？而雙標準曲線法需要對內參基因和目的基因分別做標準曲線，是用對照組擴增兩個基因得到嗎？ 在線等！求詳解！多謝了…… [ Last edited by dhd997 on 2011-9-13 at 07:51 ] |
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 【分子生物】EPI帖 |
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4樓2011-09-13 09:33:37
wanhscn
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西瓜(金幣+1): 版主很熱心啊 2011-09-13 11:57:07
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2樓2011-09-13 08:27:16
wqj1988926
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5樓2011-09-13 12:56:09
空谷幽風
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【答案】應助回帖
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西瓜(金幣+3, MolEPI+1): 居然漏評了，失職失職…… 2011-11-01 17:51:35
西瓜(金幣+3, MolEPI+1): 居然漏評了，失職失職…… 2011-11-01 17:51:35
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1.關于引物設計，現在常用的引物設計軟件都可以。 2.關于定量方法：有相對定量和絕對定量兩種，絕對定量需要做標準曲線，所以要用到標準品，所謂的標準品就是你要擴增的片段，并且要能確定它的拷貝數，因此標準品的制備是比較困難的；另一種就是相對定量，這種方法通過把參照Ct值調整到同一水平從而來校正兩個樣本的Ct值，然后對校正后的Ct值進行比較分析，根據你的描述做相對定量就可以了，所以沒必要制備標準品。 3.關于內參，原則上只要能保證這個參照在不同樣本中的穩(wěn)定性就可以，具體選什么還是多查查資料 |
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夢想起飛7樓2011-09-14 11:10:05
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