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wanhscn木蟲 (職業(yè)作家)
哲學@草根
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[交流]
【轉】我在SDS-PAGE中所犯的錯誤，歡迎補充！ 已有29人參與
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(1)我的SDS-PAGE 用了半年卻還能用。10%SDS溶液兩年了目前好著呢，他是結晶的用前熱水浴溶解即可，常溫保存。AP用一個月肯定沒有問題。TEMED好像用了10年了，沒有問題，不可思議。但快過期的甲叉試劑會使膠凝固時，梳子的齒處長短不齊。 ________________________________________ (2)我們用的是Invitrogen的kit, 我做的不多，只做過GFP，也列下錯誤： 1. 用錯了running buffer,跑出來的帶呈彩虹弧形，而且跑得非常慢 2. 第一次抗體濃度過高（1/500），跑出來的帶看不出濃度差異，第二次一級抗體和耳機抗體的稀釋比率分別是（1/1000和1/4000），效果比較理想。 3.目前正在進行中的是一次跑兩批蛋白(兩張膠），但是出來結果一張有一張白版，不知道是什么原因。。。 ________________________________________ (3)我也是剛進實驗室，盡犯些不該犯得小卻致命的錯誤，每次都懊惱得想撞墻，現(xiàn)得一結論，做實驗一定到認真，每次都把protocol重寫一邊，做到哪劃到哪，省得出錯。 ________________________________________ (4)今天第一次灌膠 所用設備為BIO-RAD 為防止漏膠 先在下層小心鋪一層速凝膠 （可在加TEMED之前取0.5ml分離膠液于另一小器皿中 然后加入10微升TEMED 然后灌速凝膠）靜置3分鐘后按常規(guī)方法灌分離膠 濃縮膠，結果未見漏膠情況發(fā)生。另外本人在流水沖洗下拔梳子 結果未見梳孔歪斜情況發(fā)生。第一次灌膠即比較成功。 ________________________________________ (5)我的錯誤才搞笑，剛進實驗室時做膠， 分離膠的配方和濃縮都弄成一樣的了． 還和別人討論錯誤在哪里？怎么總是在分離膠就有帶 狂暈ing～～ ________________________________________ (6)一次有個師弟過來告訴我,他的SDS-PAGE上不了樣 我有些奇怪,過去看究竟,果然,他把樣品加入點樣孔之后,樣品不是沉到底部,而是象蘭色煙霧一樣從孔內飄起來,很快飄散干凈 感覺是樣品忽然變輕了,或者----電泳緩沖液變重了 后來發(fā)現(xiàn)原因是后者,原來他倒錯了電泳緩沖液,把10倍的緩沖液倒進了電泳槽,換回來就行了 ________________________________________ (7)我是新手正在做WB，我想請教各位高手一個問題，我跑了三次膠每次都跑成哭臉，我求助過一些高手，說可能是膠的底部有氣泡所致，我仔細看了我作的膠底部確實有許多氣泡，不論我怎么小心，有時在剛灌完分離膠時沒有明顯的氣泡，靜置一會后在膠的底部回出現(xiàn)許多小氣泡，這是什么原因呢？ 膠凝固后體積會縮小。你可以加少許緩沖液后把槽傾斜，將氣泡趕掉。 ________________________________________ (8)我所犯的錯誤也不少。 沒加BUFFER就煮蛋白樣品，結果全沉淀了，樣品只能扔掉。 轉膜忘了冰浴。不過，作出來的結果沒有受到影響。 膜上面忘了標記號，做完了不知道是什么樣品了。建議用鉛筆在MARKER的位置標個記號。 膠冬天氣溫低時不容易凝固，可以將AP，TEMED加倍，放在37度里。 AP，TEMED，每次配1ml都是放四度，最長可能用了2個月沒問題，SDS放在室溫，1年了，好像沒什么影響。 不要迷信進口抗體，進口抗體也會有時候做不出來。 ________________________________________ (9)我們也是加大AP濃度來加快凝膠速度的，不過有一次加大太多，凝得太快跑出來條帶有點歪歪扭扭的，不好看，建議30min左右聚合就可以了，太快也不好。 另外我們圖便宜，用了國產的槽。還不錯，跟借來的Bio-rad差不多，不用封，也不漏膠，只是沒有那個塑料剝膠板，便宜��！這樣已經不錯了！ ________________________________________ (10)我覺得防止記錯加樣順序的方法可以是，MARKER兩邊加不同個數(shù)的樣本。如：MARKER左邊加了4個，右邊加了5個。脫色完了，一看就明白了。 我就是這樣干的，個人有點懶，就經常用這個方法 ________________________________________ (11)前些日子做SDSPAGE，做了兩天，犯了一大堆錯誤，寫出來供大家借鑒： 1 聽有人說瓊脂粉可以做封底膠，一試，漏了，還是用瓊脂糖吧。 2 AP用別人舊的，結果膠不干 3 A液，B液用舊的，不干。 結論：不要用別人的，一定要自已配，別怕浪費。 4 前后Tris 的PH值搞錯，結果不凝 5 電泳時長板接負極，反了 6 剝膠時，忘了切角，自已都不記得哪是哪的。 再剝時，分離膠與積層膠分開了，又搞不清什么是什么了。(可以用注射器向膠與玻璃之間注水，就可以很完整的剝下來。) ________________________________________ (12)我們也是bio-rad的不用封底， 對于APS個人覺得每個實驗室應該形成一種規(guī)則，就是所有配置的溶液都寫上日期和標簽，并注明操作的人名，這樣是一種負責的態(tài)度，除了問題很溶液找到來源，另外日期可以很明白判斷是否過期，APS一般一個星期4度下， 浪費也是可恥的，不要把實驗室的東西不擋自己的。另外配置母液的時候最好用超純水，這樣配置的緩沖液放一年都沒有什么問題。 ________________________________________ (13)要想跑出好的膠，有條件的可以在最后加入APS或TEMED前，給混合的溶液脫脫氣，效果會好些。 列舉一些新人犯的錯誤： 1 配膠時加錯試劑； 2 電泳時未通電或未及時通電； 3 先上樣后加緩沖液； 4 正負極搞反； 5 緩沖液沒加夠，浸沒不了濃縮膠，電路不通； 6 樣品煮完沒離心；離心是為了去除不溶性顆粒，不然會影響電泳。 7 電泳時未用的上樣孔沒1X上樣緩沖； 8 電泳過程中漏液等 ________________________________________ (14)我也說一下自己遇到的問題 1.膠凝時放入37度溫箱，誰知溫度比設置的高了一兩度，膠凝后發(fā)現(xiàn)邊緣不平整，所以后來我一直將溫度調在34度，沒出過問題，呵呵 2.配好分離膠后，液面用異丙醇封閉，用槍加異丙醇時太猛了，使膠邊緣凝聚的不平整。所以以后加異丙醇時要輕輕的 。 [ Last edited by wanhscn on 2011-9-13 at 16:32 ] |
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