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liweiwei0812銅蟲 (小有名氣)
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[交流]
SNP檢測問題 已有3人參與
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| 用HRM方法檢測SNP位點(diǎn)，目的片段是否有大小限制？ |
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wanhscn
木蟲 (職業(yè)作家)
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
dhd997(金幣+10, MolEPI+1): 三樓一起獎勵了 2011-09-13 18:09:17
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dhd997(金幣+10, MolEPI+1): 三樓一起獎勵了 2011-09-13 18:09:17
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先發(fā)個簡單介紹 HRM技術(shù)服務(wù)之SNP檢測（snp檢測的最佳方案） 單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs），指單個核苷酸堿基的改變，包括置換、顛換、缺失和插入，導(dǎo)致的核酸序列的多態(tài)性。在不同個體的同一條染色體或同一位點(diǎn)的核苷酸序列中，絕大多數(shù)核苷酸序列一致而只有一個堿基不同的現(xiàn)象，這就是SNP。SNP在人類基因組中數(shù)量較多，發(fā)生頻率較高，因此被認(rèn)為是繼微衛(wèi)星之后的新一代遺傳學(xué)標(biāo)記。 HRM檢測SNP技術(shù)是依據(jù)在一定的溫度范圍內(nèi)將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行變性，期間實時檢測體系內(nèi)熒光信號。熒光值隨著溫度變化，可繪制溶解曲線。每一段DNA都有其獨(dú)特的序列，因而也就有了獨(dú)特的熔解曲線形狀，如同DNA指紋圖譜一樣，具有很高的特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。根據(jù)曲線準(zhǔn)確區(qū)分野生型純合子、雜合子和突變性純合子（下圖）。 檢測SNP的方法有很多種。成本較低、通量較大的方法大都局限于已知、特定位點(diǎn)，如Taqman探針法。既要對已知位點(diǎn)分析又要查找未知位點(diǎn)，一般采用PCR+測序的方法，成本高、操作繁復(fù)較低。 優(yōu)點(diǎn)（商家宣稱）： 作為新一代的遺傳掃描工具,HRM技術(shù)是一種低成本、高通量、快速，且不受位點(diǎn)局限的檢測方法，是SNP篩查的最佳選擇。其具有"簡、效、快、廉"等其他技術(shù)難以比擬的優(yōu)勢: 簡：無需序列特異性探針,不受堿基位點(diǎn)局限,同時檢出已知或未知突變、SNP和甲基化位點(diǎn)：閉管操作，避免交叉污染。 效：最低檢測0.1%-0，01%的突變或異常甲基化檢測SNP靈敏度和特異性均為100%，。 快：1次同時不多于384個樣本，在60-90分鐘內(nèi)完成檢測。 廉：簡化操作步驟、降低人工和試劑成本，費(fèi)用遠(yuǎn)少于測序、Taqman探針等方法。 HRM技術(shù)特別適用于樣本量多、檢測位點(diǎn)較少的SNP、突變或甲基化分析，是不同于基因芯片檢測方法（檢測位點(diǎn)多，樣本少）的高通量方法。同時，也是基因芯片篩選后的多個基因在更多標(biāo)本中驗證的最佳方法。 [ Last edited by wanhscn on 2011-9-13 at 18:03 ] |
2樓2011-09-13 17:52:08
wanhscn
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關(guān)于這項技術(shù)的不同聲音： 1.HRM技術(shù)一個反應(yīng)只能檢測一個片段中的突變，從SNP檢測數(shù)目上根本不能稱為高通量。Illumina的GoldenGate可以同時檢測上千個SNP，BeadXpress也能同時檢測幾百個SNP，Sequenome的MassArray一個反應(yīng)可以檢測20個以上的SNP，Luminex的xTAG也能在一個反應(yīng)中檢測20個甚至更多的SNP。這一點(diǎn)上，HRM沒有任何優(yōu)勢； 2.如果說的是樣品的高通量，那么以上的技術(shù)都有基于96孔板和384孔板的平臺，這一點(diǎn)上HRM也沒有優(yōu)勢； 3.HRM的結(jié)果判斷依賴于變性-復(fù)性曲線的擬合，每一個片段必須反復(fù)摸索，費(fèi)時費(fèi)力；而且結(jié)果的判斷依賴于對照，并不是直接基于核酸序列獲得的結(jié)果，結(jié)果受儀器的狀態(tài)的影響很大；其精度無法與Sequenome或Luminex、TaqMan等相比。 SNP分析基于不同的目的，應(yīng)該選用不同的平臺： 1.如果是在一個群體中分析大量SNP（幾百甚至上千），研究群體遺傳結(jié)構(gòu)和進(jìn)化等，建議選用Ilumina的GoldenGate或BeadXpress； 2.如果檢測幾十個SNP，建議采用Sequonome的MassArray或Luminex的xTAG; 3.如果只檢測少數(shù)幾個SNP，而樣品較多，HRM是一個選擇，但不是唯一的選擇，TaqMan，Luminex甚至直接測序都可以考慮。 [ Last edited by wanhscn on 2011-9-13 at 18:04 ] |
3樓2011-09-13 17:57:15
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