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joyjane88銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
各位蟲友，誰做過原核基因組補(bǔ)洞工作，本人遇到一些問題想請教一下。
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| 各位蟲友，本人正在完善實驗室一株細(xì)菌的基因組全圖，也就是gap closure這項工作。前期的一些gaps很容易就搞定了，pcr+sequencing.現(xiàn)在到接近尾聲的地步了，剩下幾個gaps,兩個sequece gaps,三四個physical gaps，嘗試了多種方法都得不到PCR產(chǎn)物。用過的PCR方法有常規(guī)-，長距離-，多重-PCR，使用過高GC buffer，調(diào)整過引物、模板濃度和酶的用量，重新設(shè)計了引物，Takara的genome walking kit也嘗試過了。是不是還有哪些方面可以改進(jìn)，或者還有什么方法可以嘗試？？？現(xiàn)在有點不知所措，望各位好心的蟲友們多多給些意見和建議。 |
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lly401064
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【答案】應(yīng)助回帖
joyjane88(金幣+5): 謝謝，曾經(jīng)blast gap側(cè)翼序列，其中一個內(nèi)洞兩側(cè)和另一株菌比對上，中間有幾百bp，想來這個gap是拼裝錯誤的可能性不大�？删褪荘CR擴(kuò)不出來，而且“另一菌株”用相同的引物就能擴(kuò)出來。經(jīng)分析gap這個地方是較長序列片段的重復(fù)，避開重復(fù)序列設(shè)計引物依然無果。能否再給點意見，謝謝�。。� 2011-10-04 15:50:18
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你好，我有兩個建議： 首先考慮一下有沒有錯拼的可能性，其次是在距離gap末端相對較遠(yuǎn)的地方設(shè)計引物，因為NGS測序有可能會出現(xiàn)錯誤。 希望能夠?qū)δ愕膯栴}有所幫助。 |
2樓2011-10-04 13:50:19
lly401064
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3樓2011-10-05 15:56:51
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