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joyjane88銅蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
各位蟲(chóng)友，誰(shuí)做過(guò)原核基因組補(bǔ)洞工作，本人遇到一些問(wèn)題想請(qǐng)教一下。
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| 各位蟲(chóng)友，本人正在完善實(shí)驗(yàn)室一株細(xì)菌的基因組全圖，也就是gap closure這項(xiàng)工作。前期的一些gaps很容易就搞定了，pcr+sequencing.現(xiàn)在到接近尾聲的地步了，剩下幾個(gè)gaps,兩個(gè)sequece gaps,三四個(gè)physical gaps，嘗試了多種方法都得不到PCR產(chǎn)物。用過(guò)的PCR方法有常規(guī)-，長(zhǎng)距離-，多重-PCR，使用過(guò)高GC buffer，調(diào)整過(guò)引物、模板濃度和酶的用量，重新設(shè)計(jì)了引物，Takara的genome walking kit也嘗試過(guò)了。是不是還有哪些方面可以改進(jìn)，或者還有什么方法可以嘗試？？？現(xiàn)在有點(diǎn)不知所措，望各位好心的蟲(chóng)友們多多給些意見(jiàn)和建議。 |
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lly401064
木蟲(chóng) (初入文壇)
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3樓2011-10-05 15:56:51
lly401064
木蟲(chóng) (初入文壇)
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【答案】應(yīng)助回帖
joyjane88(金幣+5): 謝謝，曾經(jīng)blast gap側(cè)翼序列，其中一個(gè)內(nèi)洞兩側(cè)和另一株菌比對(duì)上，中間有幾百bp，想來(lái)這個(gè)gap是拼裝錯(cuò)誤的可能性不大。可就是PCR擴(kuò)不出來(lái)，而且“另一菌株”用相同的引物就能擴(kuò)出來(lái)。經(jīng)分析gap這個(gè)地方是較長(zhǎng)序列片段的重復(fù)，避開(kāi)重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物依然無(wú)果。能否再給點(diǎn)意見(jiàn)，謝謝�。�！ 2011-10-04 15:50:18
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你好，我有兩個(gè)建議： 首先考慮一下有沒(méi)有錯(cuò)拼的可能性，其次是在距離gap末端相對(duì)較遠(yuǎn)的地方設(shè)計(jì)引物，因?yàn)镹GS測(cè)序有可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤。 希望能夠?qū)δ愕膯?wèn)題有所幫助。 |
2樓2011-10-04 13:50:19
大嘴猴123
木蟲(chóng) (小有名氣)
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