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[交流]
求助：純化蛋白遇到包涵體了，尿素怎么用？
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純化大腸桿菌重組蛋白，遇到包涵體了，超聲裂解不能澄清，離心后蛋白全在菌體沉淀里面 低溫誘導(dǎo)貌似沒什么效果。。。。。。請問大家用什么方法釋放出來包涵體呢？ 有人用8M尿素處理超聲成功破裂包涵體 我的問題是，8M的尿素怎么去掉呢？我們的蛋白是GST標(biāo)簽的，是打算用GST瓊脂糖柱子純化的。。。。我不知道8M的尿素對柱子有沒有什么影響呢？ |
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7樓2011-10-05 09:11:47
btx362237729(金幣+3): 非常感謝 2011-10-04 13:36:46
amisking(BioEPI+1): 鼓勵應(yīng)助。 2011-10-04 18:51:24
amisking(BioEPI+1): 鼓勵應(yīng)助。 2011-10-04 18:51:24
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上柱之前先進行包涵體的復(fù)性 （1）將溶解的包涵體裝入已經(jīng)處理好的透析袋中，封好口，。 （2）放于4℃復(fù)性緩沖液中進行梯度復(fù)性，間隔時間為10-12h，復(fù)性緩沖液的濃度分別為：4.5mmol/L、3.5mmol/L、2.5mmol/L、1.5mmol/L、0.5mmol/L、0mmol/L。 （3）取出復(fù)性后的蛋白溶液12000rpm離心20min，取上清，分別取少量的上清和少許的沉淀進行SDS-PAGE，檢測復(fù)性情況。 復(fù)性緩沖液：PBS 1mmol/LEDTA +尿素 |
2樓2011-10-04 13:16:47
3樓2011-10-04 13:17:59
★ ★ ★ ★
amisking(金幣+4): 鼓勵應(yīng)助。 2011-10-04 18:51:31
amisking(金幣+4): 鼓勵應(yīng)助。 2011-10-04 18:51:31
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復(fù)性緩沖液的濃度分別為：4.5mmol/L、3.5mmol/L、2.5mmol/L、1.5mmol/L、0.5mmol/L、0mmol/L。 復(fù)性緩沖液：PBS 1mmol/LEDTA +尿素 抱歉這個濃度沒看懂呢，是指的尿素的濃度嗎？ 聽說尿素處理后GST標(biāo)簽蛋白的結(jié)構(gòu)被破壞得很嚴重，復(fù)性效果也不好，不知道是不是真的？ 復(fù)性就指去除尿素，然后蛋白質(zhì)自己折疊？導(dǎo)師說我們這個蛋白就是個直的，不需要折疊，那么主要就要復(fù)性GST了 |
4樓2011-10-04 13:30:32
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