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chuey木蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助微生物琥珀酸脫氫酶測(cè)定問題
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| 到底怎么處理啊，是要上清液還是沉淀啊。線粒體怎么破碎啊 ？ |
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chuey
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7樓2011-10-13 08:53:00
HarveyWang
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【答案】應(yīng)助回帖
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scelab(金幣+5, MicEPI+1): 強(qiáng)大，學(xué)習(xí)了 2011-10-11 20:56:17
scelab(金幣+5, MicEPI+1): 強(qiáng)大，學(xué)習(xí)了 2011-10-11 20:56:17
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線粒體測(cè)定SDH可以用磷酸緩沖液破碎，pH就用SDH測(cè)定反應(yīng)液的pH即可，一般為pH7.5。就用100 mM的KH2PO4-NaOH冰浴懸浮，超聲破碎。一般50-100次超聲，每次3sec，間隔5sec。 若破碎液只是測(cè)定SDH，則可以再破碎后向其中加入2%的Tween-80，然后震蕩幾分鐘，這樣可以充分提取SDH。 SDH 測(cè)定需要細(xì)胞全液。SDH在細(xì)胞破碎液離心上清和細(xì)胞沉淀中 都有，都不能忽略。不信，你可以分別測(cè)定上清和沉淀的SDH活性看看。 |
2樓2011-10-11 20:07:31
chuey
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3樓2011-10-11 20:29:01
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【答案】應(yīng)助回帖
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scelab(金幣+9, MicEPI+1): 謝謝熱心回復(fù)~ 2011-10-13 01:00:12
scelab(金幣+9, MicEPI+1): 謝謝熱心回復(fù)~ 2011-10-13 01:00:12
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你破碎真菌的菌絲體，就相當(dāng)于破碎線粒體了。 如果你只想測(cè)定線粒體的SDH活性，那么你需要先提取線粒體再測(cè)定。 用全液，當(dāng)然有懸浮物， 關(guān)鍵是你要的是全液的，還是上清的，還是沉淀的SDH活性。 一般來說，測(cè)定時(shí)20-50uL 測(cè)活性就夠了。 在反應(yīng)的保溫階段，樣品造成的吸光值背景就穩(wěn)定了。 而你測(cè)定的是吸光值的下降。 我是加入底物啟動(dòng)反應(yīng)，而不是加入酶液啟動(dòng)反應(yīng)的。 |
4樓2011-10-11 21:28:13
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