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小丫的維尼熊木蟲 (小有名氣)
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[交流]
DNA限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)
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1. 底物DNA沒有被所用限制酶切斷，為什么? 1.1 底物DNA上沒有該限制酶的識別、切斷位點。特別是一些經(jīng)過重組等處理的DNA，堿基易發(fā)生缺失、變化等。 1.2 限制酶識別位點上的A或C被甲基化。 部分限制酶對識別位點中的堿基是否被甲基化比較敏感，從而無法切斷該位點。被甲基化的部位，根據(jù)底物DNA及宿主種類的不同而不同。 大多數(shù)大腸桿菌都帶有2種具有特異性識別位點的甲基化酶，即dam methylase (G6mATC) 和dcm methylase (C5mCWGG)。在進(jìn)行轉(zhuǎn)化時，通常使用的菌株為C600、HB101、JM109等，因為都帶有dam、dcm甲基化酶，所以使用這些菌株制備的DNA時， 必須注意。另外，動物由來的DNA，CG序列多為5mCG；植物由來的DNA，CG及CNG序列多為5mCG和5mCNG。 1.3 底物不純。 如果底物DNA中含有限制酶阻害物質(zhì)，會影響限制酶的酶切作用。在此種情況下，底物DNA須重新進(jìn)行純化。 1.4 底物DNA種類不同，它們的大小，切點數(shù)也不同, 達(dá)到完全分解時, 所需要的酶量也不同, 從這些數(shù)據(jù)中計算出的 [完全分解1 mg DNA所需要的限制酶預(yù)計量] 與 [實際量]，也因限制酶的種類不同而有差別，這些差別被認(rèn)為是酶同其識別位點周圍的高級結(jié)構(gòu)親和程度而產(chǎn)生的。例如, 限制酶Nae I 在切斷pBR322 DNA時, 就有著非常難以切斷的部位。 1.5 Star活性（星號活性） 限制酶在一些特定條件下使用時，對于底物DNA的特異性可能降低。即可以把與原來識別的特定的DNA序列不同的堿基序列切斷，這個現(xiàn)象叫Star活性。Star活性出現(xiàn)的頻率，根據(jù)酶、底物DNA、反應(yīng)條件的不同而不同，可以說幾乎所有的限制酶都具有Star活性。并且，它們除了識別序列的范圍增大之外，還發(fā)現(xiàn)了在DNA的一條鏈上加入切口的單鏈切口活性，所以為了極力抑制Star活性，一般情況下，即使會降低反應(yīng)性能，也提倡在低甘油濃度、中性pH、高鹽濃度條件下進(jìn)行反應(yīng)。 45DNA限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)怎樣確認(rèn)酶切位點是否被甲基化? 一般情況下，從大多數(shù)的大腸桿菌中提取的DNA，幾乎都存在被甲基化的現(xiàn)象，其相對應(yīng)識別序列的受甲基化影響的限制酶即切不開該酶切位點。而只有在轉(zhuǎn)化時選用了甲基化酶欠損的大腸桿菌作為宿主，提取的DNA才不會被甲基化。在實際操作中，如果使用受甲基化酶影響的限制酶對從一般的大腸桿菌中提取的DNA進(jìn)行酶切反應(yīng)，而沒切開，或者對測序結(jié)果有酶切位點的片段，切不開，其酶切位點被甲基化的可能性就比較大，這時就要選用不受甲基化影響的限制酶進(jìn)行酶切。 |
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